[PySSyCaT]

1) Hücreler pasajlanabilmeleri için hücre kültür petrilerinin yüzeyini tamamen kaplamış olmalıdır. Böyle petrilere ‘konfluent petriler’ denir.
2) Konfluent petrilerin üzerindeki besiyeri aspire edilerek uzaklaştırılır.
3) Hücreler serumdan arındırılmak için PBS ile yıkanır,
4) PBS aspire edilerek uzaklaştırılır.Hücreler inkübatörde tripsinle 5 dakika inkübe edilir.

100 mm petri için 2 ml tripsin
6 mm petri için 1 ml tripsin
35 mm petri için 0,5 ml tripsin uygulanır.
***Farklı hücre tiplerinin tripsine duyarlılığı farklıdır. Bu yüzden tripsin uygulanan hücrelerden bazıları 5 dakikadan daha az sürede petri yüzeyinden ayrılabilir. Mikroskopta aralıklarla kontrol edilmelidir.
5) Tripsin, hacminin en az iki katı serumlu besiyeriyle inhibe edilir.
***100 mm petri için 2 ml tripsin 4 ml besiyeri
6 mm petri için 1 ml tripsin 2 ml besiyeri
35 mm petri için 0,5 ml tripsin 1ml besiyeri uygulanır.
6) Hücreler pipetlenerek tek hücre süspansiyonu haline getirilir ve bir falkon tüpe aktarılır. Tüpe 2-3 ml daha medyum ilave edilir.
7) Hücre süspansiyonu santrifüjlenir (1000-1500 rpm 5 dakika), süpernatan uzaklaştırılır.
8) Hücreler 1 ml besiyerinde sulandırılır ve sayılırlar.
9) Petrilere ekimler yapılır.

Kullanılan çözeltiler

1) Hücre Kültür Medyumu: DMEM/F12 %10 FBS ve %1 Antibiyotik (250 ml için; 225 ml DMEM/F12, 25 ml FCS ve 250 μl antibiyotik)
2) dPBS: Ticari solusyon
3) Tripsin /EDTA % 0,25 : Ticari Solüsyon

Hücre sayılarının hesaplanması

1 ml kültür medyumunda sulandırılan hücre süspansiyonundan 10 μl alınarak ependorf tüpe konur ve üzerine 90 μl Tripan Blue boyası konarak karıştırılır. Bu karışım Toma lamına konur, toma lamından 5 bölme sayılır, bulunan sayı sulandırma miktarı x50.000 sayısı ile çarpılır. Sonuç olarak 1 ml medyumda kaç milyon hücre olduğu bulunur. Ekim yapılacak sayı belirlenip hücrelerin petriye ekimleri yapılır.
Genelde 60 mm’lik konfluent bir kültür kabı 2 tane 100 mm’lik kültür medyumlu kültür kabına geçirilebilir. 100 mm hücre kabı 1/5 oranında 100 mm’lik başka bir kaba geçirilebilir. 60 mm hücre kabı 1/5 oranında 60 mm’lik başka bir kaba geçirilebilir.
100 mm’lik kültür petrisine 5x106
60 mm’lik kültür petrisine 2x 106
35 mm’lik kültür petrisine 1x106
24 kuyuluk kültür kabının her kuyusuna 125 bin hücre transfer edilmelidir.
Bunun için hücre kültür kabı sayılır ve 500.000 hücre/ml olacak şekilde dilue edilir.
100 mm’lik kültür petrisine 10 ml hücre süspansiyonu
60 mm’lik kültür petrisine 4 ml hücre süspansiyonu + 1 ml medyum
35 mm’lik kültür petrisine 2 ml hücre süspansiyonu + 1ml medyum
24 kuyuluğun her kuyusuna: 250 μl hücre süspansiyonu + 250 μl medyum.




aLinti..