Çevrimdışı

Bu forumdaki linkleri ve resimleri görebilmek için en az 25 mesajınız olması gerekir.

Amaç ve Kapsam

Gıda numunelinde L.monocytogenes aranması amacını taşır. L.monocytogenes. gram pozitif, kokobasil, sporsuz ve kapsülsüz olup katalaz pozitif, oksidaz negatif fakültatif anaerob bakterilerdir. 25 oC de hareketli olmasına karşın 37 oC da hareketsizdirler. L.monocytogenes gıdalarla bulaşan patojen bir mikroorganizmadır. Ve diğer gıda kaynaklı patojenlerin neden olduğu hastalıklardan farklı olarak ishal şeklinde değil septisemi, zatürre,ensefalitis, menenjit gibi hastalıklara hamilelerde de düşüklere neden olabilmektedir.

Prensip
L.monocytogenes aranmasında kullanılan 2 ayrı metot anlatılmaktadır.1.Metot Listeria Rapit Test Prosedürü antijen-antikor ilişkisiyle; kit kullanılarak Listeria spp.varlığı saptanırsa, zenginleştirme besiyerinden izolasyon besiyerine geçip biyokimyasal testlerle doğrulama analizidir. Listeria çalışılması zor ve tehlikeli bir bakteridir.L.monocytogenes laboratuvarda çalışma esnasında suşlarla çalışırken laboratuvarda çok sayıda L.monocytogenes bulunmasına neden olduğu için hamile yada şüphesi olan personelin analize katılmamaları uluslar arası kuruluşlar tarafından bildirilmiştir.Bu nedenle kitlerle çalışılması tercih edilebilir.

Metot ise klasik olarak kullanılan metot olup ön zenginleştirme, izolasyon ve biyokimyasal testlerle identifikasyon esasına dayanır.

Metot 1
Alet ve ekipmanlar

• Otoklav
• Sterilizatör ( 160+5 oC)
• İnkübatörler (30+1oC,)
• Analitik teraziler
• Su banyosu (80+1oC)
• pH metre
• Bunzen beki
• Steril bıçak, pens,spatül, vb. malzemeler
• Otomatik pipet ve steril pipet ucu
• Cam tüpler ve tüp sporlar
• Erlen ,beher,mezür vb. standart laboratuvar cam malzemesi

Kullanılan Besiyerleri

• FRASER BROTH :
Formül :
Proteose peptone : 5g
Tryptone : 5g
Lab-lemco powder : 5g
Yeast extract : 5g
Sodyum clorür : 5g
Disodyum hidrogen phosphate : 12g
Potasyum dihidrojen fosfat : 1,35g
Aesculin : 1g
Liytumclorür : 3g
Distile su : 1000ml

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Otklav sonrası pH 7,2+0,2 olacak şekilde ayarlanır. 121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir. 250ml’lik erlenmayerlere225ml olarak bölünür.

• Buffered Listeria Enrichment Broth (bleb) :
Formül:
Tryptone soya broth : 30g
Yeast extract : 6g
Potasyun dihidroje ortofosfat : 1,35g
Disodyum hidrojen ortofosfat : 9,6g
Distile su : 1000ml

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür, pH 7,3+0,2 ‘ye ayarlanır10ml olarak kapaklı tüplere bölünür. 121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir. Buzdolabında saklanır.

• Fraser supplement:
(Ferricamoniumcytrate 112,5mg, Nalidixic asit 2,25mg, acriflavinehydrochloride 2,8125mg) Hazır içerikli vial 4ml(1:1) su/ethanol ile çözülür.

• Listeria selective enrichment supplement :
(Nalidixic asit 20mg, Cycloheximide 25mg, acriflavinehydrochloride 7,5mg) hazır içerikli vial 2ml steril distile su ile çözülür.

• Listeria Selective Agar(Oxfort Agar)
Formül:
Columbia blood agar base : 39g
Aesculin : 1g
Ferric amonyum sitrat : 0,5g
Lityum clorür : 15g
Distile su : 500ml
Listeria selektif supplement(oxford agar için):
Cycloheximid : 200mg
Colistin sülfat : 10mg
Acriflavine : 2,5 mg
Cefotetan : 1 mg
Fosfomycin : 5mg

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür.Otoklav sonrası pH 7.0+0.2 olacak şekilde ayarlanır.Otoklavda 121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir.50 oC’ye kadar soğutulduktan sonra 5ml etanol/steril distile su karışımında süspanse edilmiş 1vial Listeria Selective Supplement (500ml besiyeri için) katılır Aseptik koşullarda petrilere dökülür.

• Listeria rapid test kiti

Kullanılan Biyokimyasal Besiyerleri
(istenirse hazır biyokimyasal test kitleri kullanılabilir)
MR-VP Besiyeri
Nitrat Broth
SIM Besiyeri
Koyun Kanlı Agarı

Uygulama

Ön Zenginleştirme:

1 vial Fraser supplement 225ml Fraser broth içine katılarak daha sonra 25g numune tartılarak ilave edilerek karıştırılır. 30oC de 21 veya 24saat inkübasyona bırakılır.

İkinci Zenginleştirme:

10 ml BLEB içeren tüplere 40µl Listeria selective enrichment supplement ‘den ve 0,1ml ön zenginleştirme sıvısından ilave edilir. 30oC de 21 veya 24saat inkübasyona bırakılır.

İşlem :

İnkübasyon sonrası ikinci zenginleştirme ortamının üst kısmından sarsmadan 2ml alınıp, küçük bir deney tüpüne aktarılır. 80oC de su banyosunda 20 dakika tutularak flagella antijeninin ekstraksiyonu sağlanır. Tüp su banyosunda alınıp oda sıcaklığına kadar soğutulur.
Listeria test kiti orijinal ambalajından çıkarılır. Düz bir zeminde kitin alt penceresine ekstrakttan 135µl aktarılır.(Test ünitesi Listeria türlerine özgü B flagella antijenlerine spesifik monoklonal antikorlar içerir.Ekstrakte edilen antijen, membran üzerindeki antikor ile işaretlenmiş mavi latex içeren örnek penceresine ilave edildiğinde antijen/lateks kompleksi oluşur.Bu complex hat üzerinde kapiller hareket ile sonuç penceresindeki sabitlenmiş monoclonal anti-flagellin antikoruna doğru yönelir.Antijen/latex kompleksi ve sabitlenmiş spesifik monoclonal antikor arasında reaksiyon oluştuğunda sonuç penceresinde mavi bir hat gözlenir.Eğer hiç flagella antijeni yok ise sonuç penceresinde renk değişimi gözlenmez.Antijen ile complex oluşturmayan antikor ile işaretlenmiş mavi latex fazlası hat üzerinde ilerlemeye devam eder ve kontrol penceresinde sabitlenmiş spesifik olmayan poliklonal antikor ile reaksiyona girerek kontrol penceresinde mavi bir hat oluşturur) 20 dakika sonunda sonuç okunur.

Sonuç penceresinde mavi hat oluşuyorsa Listeria sp. pozitiftir. Kontrol penceresinde ise her zaman mavi hat oluşur; bu durum kitin çalıştığını gösterir. Sonuç ve kontrol pencerelerinde gelişen mavi hattın renk yoğunluğu farklı olabilir, ancak bu farklılık sonuçların değerlendirilmesinde dikkate alınmamalıdır. Çok az bir olasılıkla da olsa sonuç penceresinde kuvvetli bir mavi hat oluşmasına karşılık kontrol penceresinde mavi hat görülmemesi flagella antijeninin oldukça yüksek düzeyde olduğunu gösterir. Bu durumda kontrolün sonuç vermesi için ekstrakt tamponlu Listeria zenginleştirme besiyeri ile 1:10 oranında seyreltilerek test tekrar edilir. Ekstraktın bir saatten fazla beklememiş olmasına dikkat edilmelidir.

Not: Çalışmaya başlamadan önce kitin denenmesi için test paketi içinden çıkan ve liyofilize flagella antijenini içeren pozitif kontrol tüpü 2 ml steril su içinde çözündürülür ve test kitinin alt penceresine 135 μl aktarılır. İki pencerede de mavi hat oluşumu beklenir.

• İki pencerede de mavi hat oluşumu gözlenirse kalan ikinci zenginleştirme BLEB besiyerinden tekrar BLEB besiyerine geçilip aynı şekilde inkübasyona bırakılır.24 saat sonra BLEB’den Listeria Selective Agar(Oxfort Agar) besiyerine öze ile geçilerek 35 oC’de 24-48 saat inkübasyon sonrasında oluşan siyah koloniler doğrulama için tekrar besiyerine yada kanlı agara geçilir.Biyokimyasal doğrulama yapılır.

Doğrulama Testleri

Biyokimyasal testler Sonuç
Nitrat indirgeme testi –
Kanlı agarda Beta hemoliz +
Sim agarda hareket + (tipik şemsiye görünümü)
MR/VP +/+
Camp testi +
H2S –
Dekstroz +
Ramnoz +
Mannitol –

Kaynak

Listeria Rapid Test Prosedürü (OXOİD)

Metot 2

Alet ve Ekipmanlar

• Otoklav
• Sterilizatör ( 160+5 oC)
• İnkübatörler (30+1oC, 35+1oC)
• Analitik teraziler
• Su banyosu (80+1oC)
• pH metre
• Bunzen beki
• Steril bıçak, pens,spatül, vb. malzemeler
• Otomatik pipet ve steril pipet ucu
• Cam tüpler ve tüp sporlar
• Erlen ,beher,mezür vb. standart laboratuvar cam malzemesi

Kullanılan Besiyerleri

• Buffered Listeria Enrichment Broth :
Formül:
Tryptone soya broth : 30g
Yeast extract : 6g
Potasyun dihidroje ortofosfat : 1,35g
Disodyum hidrojen ortofosfat : 9,6g
Distile su : 1000ml

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. Otoklav sonrası pH 7,3+0,1 olacak şekilde ayarlanır. 121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir.Filitre ile sterilize edilmiş 2,5 ml %10’luk sodyum pruvat eklenir.Aseptik koşullarda 250ml’lik erlenmayerlere225ml olarak bölünür.

• Listeria selective enrichment supplement :
Nalidixic asit : 40mg……%0,5lik distile sulu çözeltisi
Cycloheximide : 50mg…….% 1lik etanol(%40) çözeltisi
Acriflavinehydrochloride : 10mg…….%0,55lik distile sulu çözeltisi

225 ml hazırlanmış broth içine 4 saatlik inkübasyondan sonra 0,455ml Acriflavin,1,8ml Nalidixic asit ve 1,15ml Cycloheximide ilave edilir.Kullanılan bu selectif maddeler hazır vialler halinde ticari olarak satılır ve bu tip kullanım tercih edilmelidir.

• Listeria Selective Agar(Oxfort Agar)
Formül:
Columbia blood agar base : 39g
Aesculin : 1g
Ferric amonyum sitrat : 0,5g
Lityum clorür : 15g
Distile su : 1000ml
Supplement(oxford agar için):
Cycloheximid : 400mg
Colistin sülfat : 20mg
Acriflavine : 5 mg
Cefotetan : 2 mg
Fosfomycin : 10mg

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür.Otoklav sonrası pH 7.0+0.2 olacak şekilde ayarlanır.Otoklavda 121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir.50 oC’ye kadar soğutulduktan sonra 10ml etanol/steril distile su karışımında süspanse edilmiş supplement (1000ml besiyeri için) katılır.(Suplementlerin hazır ticari formları tavsiye edilir.) Aseptik koşullarda petrilere dökülür.

• Palcam Agar
Formül:
Pepton : 11.5g
Starch : 0.5g
NaCl : 2.5g
Columbia agar : 6.5g
Monnitol : 5g
Ferric amonyum sitrat : 0.25g
Aesculin : 0,4g
Glucose : 0,25g
Phenol red : 0,04g
Lityum clorür : 7.5g
Distile su : 500ml

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür.Otoklav sonrası pH 7.2+0.2 olacak şekilde ayarlanır.Otoklavda 121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir.

• Supplement
Polymixin B : 5mg
Acriflavine hydrochloride : 2,5mg
Ceftazidime : 10mg
Selektif maddeler 1ml steril distile su ile çözündürülüp 50 oC’ye kadar soğutulan 500ml palcam besiyerine katılır, karıştırılır. .(Suplementlerin hazır ticari formları tavsiye edilir.) Aseptik koşullarda petrilere dökülür.

• Yeast Ekstrakli Trypticase Soy Agar(Tsaye)
Formül:
Trypticase soy agar : 40g
Yeast extract : 6g
Distile su :1000ml

Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür.Otoklav sonrası pH 7.3+0.2 olacak şekilde ayarlanır.Otoklavda 121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir. Aseptik koşullarda petrilere dökülür.

Kullanılan Biyokimyasal Besiyerleri
(istenirse hazır biyokimyasal test kitleri kullanılabilir)

MR-VP Besiyeri
Nitrat Broth
SIM Besiyeri
Koyun Kanlı Agarı

Uygulama

Ön Zenginleştirme:

25g numune tartılarak 225 ml Supplement içermeyem BLEB besiyerine konur ve 30+1 oC ‘de 4 saat inkübasyona bırakılır. Daha sonra akriflavin, nalidiksik asit, cycloheximide içeren supplement içeriği ilave edilir ve 30+1 oC ‘ 44+2 saat toplam 48 saat inkübasyona bırakılır

İzolasyon

Zenginleştirme besiyerinden öze ile Oxfort ve Palcam Agar besiyerlerine geçilir ve petriler 35+1 oC’de 24-48 saat inkübasyona bırakılır. inkübasyon sonrasında Oxfort agarda oluşan 2-3 mm çapında siyahımsı çökük merkezli siyah-kahverengi koloniler ve palcam agarda 1.5-2 mm çapında zeytin yeşili-gri renkli siyah zonlu koloniler şüpheli kabul edilerek doğrulama testlerine alınır.

Doğrulama Testleri

TSAYA besiyerine geçilen şüpheli koloniler 35+1 oC’de 24-48 saat inkübasyondan sonra 1-2 mm çapında konveks renksiz yada opak düzgün kenarlı koloniler oluşturur.Bu petriler alttan ışık alacak şekilde mikroskoba yerleştirilir.Beyaz bir ışık kaynağından çıkan ışınlar 45o açı ile aynaya buradan da 45o açı ile petri kutusuna gelir bu şekilde oluşan ışık kırılması ile koloni mavi renkte görülür.Ayrıca Metot 1 de ki doğrulama testleri yapılır.




aLinti..

__________________

#MustafaKemaLAtatürkTorunuyum..ღ ❦

{22~02~`22..∞}
{09~09~`22..ღ}