Besiyerleri; mikroorganizmaları bulundukları ortam dışında ve laboratuvarlarda üretmek için formüle edilmiş, mikroorganizmaların gereksinimini olan besin ögelerini içeren, pH’ı uygun, besleyici, katı veya sıvı, yapay ortamlardır.
Besi yerlerine; ortam= vasat= kültür ortamı= kültür vasatı= kültür besi yeri gibi isimler de verilmektedir. Besi yerinin İngilizce karşılığı ‘medium’ dur. Besi yerleri çok farklı amaçlarla kullanılabilir. Bunlar mikroorganizmaların; üretilmesi, geliştirilmesi ve canlılıklarının korunması, duyarlılık ve sterilite testleri, saf kültürlerinin elde edilmesi(izolasyonu), tanımlanmaları (identifikasyon), sayımları, yapılarının ve biyokimyasal özelliklerinin incelenmesi, biyolojik ve metabolik ürünlerinin elde edilmesi, gıda su ve çevre kontrolleri, antibiyotik ve vitamin analizleri olabilir.
Mikroorganizmaların kalıtsal yapıları ve enzim sistemleri farklı olmakla birlikte, tüm mikroorganizmaların bir ortamda gelişebilmesi için suya, bir enerji kaynağına (ışık veya kimyasal), bir karbon kaynağına (organik veya inorganik), bir azot kaynağına (organik veya inorganik), vitamin ve mineral maddelere gereksinimleri vardır.
Besi yerleri bileşiminde mutlaka bulunması gereken maddeler:
· Su,
· Karbohidratlar veya karbohidratlar bulunmadığı ya da yetersiz olduğunda proteinler gibi enerji kaynakları,
· Proteinler, peptonlar, amino asitler
vb. organik bileşikler, KNO3, (NH4)PO4
vb. inorganik tuzlar gibi azot kaynağı maddeler,
· Vitaminler(özellikle B grubu), pürin ve primidin bazları, amino asitler gibi üreme faktörleri,
· Na, K, Cl, P, Ca, Fe, Mg, S
vb. makro elementlerle, Zn, Mg, Br, Mo, Co, Cu, B
vb mikro elementler yani minerallerdir.
Bazı mikroorganizmalar çok basit ortamlarda üreyebilirken, bazı mikroorganizmaların, gelişebilmesi ve üretilmesi için ortama üreme faktörleri, organik ve inorganik bileşiklerin ilave edilmesi gerekir. Ayrıca patojen bakteriler ve laktik asit bakterileri
vb üretiminde kullanılacak besi yerlerine seçici veya ayırt edici maddeler de katılmaktadır.
Bu nedenlerle tüm mikroorganizmalar için uygun tek bir besi yeri formülü yoktur.
Laboratuvarlarda
· Kullanım amacına,
· Bileşimine,
· Hazırlanış şekline göre uygun besi yeri seçilir.
Laboratuvarlarda kullanılan besiyerleri, bitki ve hayvan dokularının ezilmesinden veya ekstraksiyonlarının karıştırılmasından elde edilir.
Besi Yeri Çeşitleri
Besi yerleri sınıflandırılması farklı şekillerde yapılabilir.
Fiziksel Özelliklerine Göre Besi Yeri Çeşitleri
Sıvı Besiyerleri: İçinde katılaştırıcı madde bulunmayan daha çok mikroorganizmaların üretilmesinde kullanılan besi yerleridir. Örneğin et suyu, peptonlu su, Nutrient Broth (besleyici buyyon).
Katı Besiyerleri: Bileşimine kıvam verici, katılaştırıcı madde katılmış besiyerleridir. Katılaştırıcı madde olarak en çok agar daha az olarak da jelâtin, yumurta, serum, alginatlar ve silika jel kullanılır. Örneğin Nutrient Agar, EMB Agar gibi.
Kaynaklarına Göre Besi Yeri Çeşitleri
Hayvansal Kaynaklı Besi Yerleri: Yumurta sarısı, karaciğer, balık unu, süt, et suyu gibi hayvansal dokulardan elde edilmiş besi yerleridir.
Bitkisel Kaynaklı Besi Yerleri: Patates ekstraktı, portakal serumu gibi bitkisel dokulardan elde edilmiş besi yerleridir.
Kullanım Amacına Göre Besi Yeri Çeşitleri
Genel Besi Yerleri: Mikroorganizmalar için gerekli besin maddelerince yeterli ve zengin, belli bir mikroorganizma grubunun gelişmesini özel olarak artırmayan, birçok mikroorganizmaların gelişmesini sağlayan besi yerleridir. Tüm mikroorganizmaların gelişilebileceği özellikte bir besi yeri yoktur. Genel besi yerlerinde laktik asit bakterileri ve patojen bakteriler dışında pek çok mikroorganizma gelişebilir.
Genel besiyerleri diğer bazı besi yerlerinin hazırlanmasında temel besi yeri olarak kullanılır. Örneğin Nutrient Broth, Nutrient Agar.
Genel besiyerleri aşağıdaki amaçlar için kullanılır:
· Toplam mezofil ve psikrofil aerob bakteri sayımı
· Bozulma veya hastalık etmeninin ön izolasyonu
· Günlük kullanımdaki bakterilerin aktifleştirilmesi, korunması
· Genel besi yerleri inkübasyon koşullarının değiştirilmesi ve kontrolü
· Anaerob mikroorganizmaların geliştirilmesi
Nutrient Broth ve Nutrient Agar gibi genel besi yerlerine maya ekstraktı, süt, serum, kan gibi maddeler ilave edilerek istenen amaca uygun, farklı besi yerleri elde edilir.
Özel Besi Yerleri: Çalışma amacına göre seçilen, belli bir mikroorganizma grubu için hazırlanan ve yapıları daha kompleks (karmaşık) olan besi yerleridir. Özel besi yerleri çok çeşitlidir.
Canlandırma Besi Yerleri: Bir ortamda zarar görmüş, üreme yeteneği azalmış, canlılık oranı düşük olan mikroorganizmaların canlanmasını, gelişmesini ve adaptasyonunu sağlayan sıvı besiyerleridir.
Selektif (Seçici) Besi Yerleri: Formülasyonu yalnızca belli bir mikroorganizma veya mikroorganizma grubunun tipik gelişimini sağlayacak şekilde hazırlanmış besi yerleridir.
Selektif besi yerlerinin bileşimine diğer istenmeyen mikroorganizmaların enzim veya metabolizma sistemlerini olumsuz etkileyen, gelişmelerini engelleyen;
· Boyalar,
· Antibiyotikler,
· Kimyasal maddeler,
· Safra tuzları gibi inhibitör maddeler pH ayarlamalarıyla istenen mikroorganizmaların gelişmeleri sağlanır.
Örneğin ortama 1/500.000 oranında kristal viyole eklendiğinde gram (+) bakteriler gelişemez; sadece gram(-) bakteriler gözlenir.
Eosin Metilen Blue Agar, SS Agar, Violet Red Bile Agar, Brillant Green Bile Broth, Mac Conkey Broth gibi.
Elektif (Seçime Yönelik) Besi Yerleri
Formülasyonu belli bir mikroorganizmanın minimum düzeyde gelişimini sağlayan besin ögelerini karşılayacak şekilde hazırlanmış besi yerleridir. Elektif besi yerleri ile karışık bir mikroorganizma kültüründen istenen mikroorganizmalar ayrılır (izole edilir). Örneğin Lizin Agar ile N(azot) kaynağı olarak yalnızca lizin amino asidini kullanabilen yabani mayalar ayrılabilir.
Diferansiyel (Farklara Dönük) Besi Yerleri
Belli bir mikroorganizmanın kendi türüne özgü tipik koloniler oluşturduğu katı besi yerleridir. Ortama bazı boya ve kimyasal maddeler katılarak mikroorganizmaların üreme şekli ayrı bir özellik kazanır. Örneğin; SS Agar Salmonella kolonilerini tanımada, EMB Agar ise E.coli’nin
ayrımında kullanılır.
Not: Bazı besi yerleri hem selektif (seçime yönelik) hem diferansiyel (farklara dönük) olabilir. Örneğin Mac Conkey Broth besi yerlerinde laktoz ve indikatör olarak da brom krezol moru vardır. Koliform bakterileri laktozu fermente ederek kırmızı renkli koloniler, laktozu fermente edemeyen Salmonella türleri ise renksiz koloniler oluşturur. Selektif, elektif ve diferansiyel besi yerleri ile gıda örneklerindeki veya karışık kültürlerdeki belli bir mikroorganizma veya mikroorganizma grubu izole edilerek saf kültürleri elde edilir.
Zenginleştirme Besi Yerleri
Karışık mikroorganizma kültüründe istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini engelleyen, izolasyonu istenen mikroorganizmaların ise bolca üreme ve gelişmesini sağlayan, genellikle sıvı besi yerleridir.
Zenginleştirme besi yerleri;
· İstenen mikroorganizmaların izolasyonu için besin ögeleri ve pH
vb. ihtiyaçlarını en iyi düzeyde karşılar.
· Bu besi yerlerinin inkübasyonu sıcaklık ve süre açısından izolasyonu istenen mikroorganizma türüne göre kontrollü olarak yapılmasını sağlar.
Örneğin Selenit Broth 16–20 saat kadar koliform bakterilerinin gelişmelerini engellediğinden, Salmonella türü bakterilerin izolasyonunda kullanılan zenginleştirme besi yeri çeşididir.
Biyokimyasal Test Besi Yerleri
Mikroorganizmaların test edilen maddede biyokimyasal değişim oluşturup oluşturmadıklarını belirlemek amacıyla kullanılan sıvı veya katı olarak hazırlanabilen besiyerleridir.
Biyokimyasal test besi yerlerine;
· Glikoz, laktoz, sakkaroz
vb. karbohidratlar,
· Nitrat, sitrat, üre tuzları,
· Brom timol mavisi, fenol kırmızısı gibi indikatörler katılarak mikroorganizmaların çeşitli biyokimyasal özellikleri saptanır.
Tamamlama ya Dd Doğrulama Besi Yerleri
İnkübasyondan sonra kültüre eklenen özel indikatörlerle (ayıraç), mikroorganizmaların metabolizma ürünlerinin saptanmasını ve tanınmalarını sağlayan besi erleridir. Tripton Water, Glikoz Fosfat Broth gibi.
İndirgenmiş Besi Yerleri
Formülasyonu oksijensiz ortamda yaşayabilen anaerob mikroorganizmaların iyi düzeyde gelişimini sağlayacak şekilde hazırlanmış besiyerleridir. İndirgenmiş besiyerlerine tiyoglikolat gibi indirgen maddeler katılır. Bu maddeler besi yerindeki çözünmüş oksijeni bağlar ve ortamı anaerob hâle getirir.
Besi Yerlerinin Bileşimine Giren Temel Maddeler
Agar
Bazı deniz yosunlarından elde edilen uzun zincirli polisakkarittir. Toz veya lifler halinde üretilir. Yapısında D-galaktopiranoz bulunur. D-galaktopiranoz katılaşma özelliği verdiğinden agar sıvı besi yerinin katılaştırılmasında kullanılır.
Pepton
Süt proteini (kazein), kan proteini (fibrin), sığır eti, karaciğer veya soya proteininin tripsin, pepsin veya papain gibi proteolitik enzimlerle hidrolize edilmesinden üretilir. Pek çok mikroorganizmada proteinleri hidrolize ederek N kaynağı olarak kullanmalarını sağlayacak proteolitik enzim sistemleri bulunmadığından besi yerine pepton katılır.
Maya Ekstraktı (Yeast Extract)
Ekmek mayası (Saccharomyces cerevisiae), bira mayası gibi mayaların enzim veya asitle hidrolizinden elde edilir.
Et Ekstraktı (Beef Extract)
Bakteriler için genel besi yeri olarak kullanılır. Yağsız, tendonları ayrılmış sığır etinden (kıymasından) elde edilir.
Tuz (NaCl)
Besi yerlerinde iyon konsantrasyonunu ayarlamak ve izotonik (eş basınçlı) ortam yaratmak için kullanılır.
Jelâtin
Sinir, kemik, tendon
vb. hayvansal dokulardan elde edilen protein yapısında bir maddedir. Agar gibi katılaştırıcı özelliği vardır fakat daha çok mikroorganizmaların proteolitik aktivitelerini ortaya çıkarmak için kullanılır.
Karbohidratlar
Fermente olabilen karbohidratlar, mikroorganizmalar için enerji ve C kaynağıdır. En çok kullanılan karbohidratlar glukoz, laktoz ve sakkarozdur.
Kan
Sıvı veya katı bazı besi yerlerini zenginleştirmek için ya da mikroorganizmaların hemoliz (alyuvarların parçalanması) özelliklerinin saptanması testlerinde kullanılır.
Tampon Maddeler (Buffer)
Mikroorganizmaların gelişimine etki eden en önemli faktörlerden biri pH’dır. Besi yerinde üreyen mikroorganizmaların metabolik artıkları ortamın pH’ını değiştirebilir. Besi yeri pH’ını kontrol altında tutmak için tampon maddeler katılır.
İnorganik maddeler
Özellikle hazır olarak satılan sentetik besi yerlerine mikroorganizmaların ihtiyacına göre mineraller eklenebilir. Fakat genellikle besi yerlerine katılan pepton, bulyon, maya ekstraktı, et ekstraktı mikroorganizmaların mineral ihtiyacını yeteri kadar karşılamaktadır.
Not: Besi yerlerine yukarıdaki maddeler dışında amaca göre inhibitörler, gelişmeyi artırıcı maddeler (stimülatörler), anaerobların gelişmesini sağlayan indirgeyici maddeler, doğal ortam oluşturan maddeler
vb katılabilir.
Besi Yerinin Sahip Olması Gereken Özellikler
· Uygun miktarda su bulunmalı yani su aktivitesi yüksek olmalı.
· Mikroorganizmaların gereksinimini karşılayacak kolayca kullanılabilir besin
maddeleri içermeli,
· Uygun asit-baz (pH) dengesine sahip olmalı,
· Berraklık, katılık gibi fiziksel özellikleri elverişli olmalı,
· Osmotik basıncı, oksidasyon/redüksiyon (indirgenme/yükseltgenme) potansiyeli
mikroorganizmalara uygun olmalı,
· ikrobiyolojik anlamda steril olmalı, sterilizasyon kontrolü yapılmalı.
Ekim öncesi sterilizasyon hazırlığı ve sterilizasyon uygulaması titizlikle
uygulanmalı,
· Dış ortamdan mikroorganizma kontaminasyonunun önlenmesi için özel kaplarda
hazırlanmalı ve saklanmalı.
Etiket Bilgisini Kullanma
Günümüzde, laboratuvarlarda bazı firmalar tarafından üretilmiş hazır karışımlar halinde, özel ambalajlarda piyasaya sunulan kuru (dehidre) besi yerleri bulunmaktadır. Hazır ticari besi yerlerinin üzerinde açıklayıcı bilgiler bulunan etiketleri vardır. Dehidre ticari besi yerlerini hazırlamak daha kolaydır laboratuvarda zamandan tasarruf sağlar. Genellikle, hazır besi yerinin ambalaj etiketinde yazılı miktarı tartılıp suda çözülerek hazırlanır ve sterilize edilir. Ancak hazır besi yerleri pahalıdır.
Etikette Yer Alan Bilgiler
Hazır ticari besi yerlerinin etiketlerinde şu bilgiler bulunur:
· Besi yerinin veya besi yeri bileşeninin ismi (pepton, Brillant Green Bile Broth ),
· Hangi laboratuvarda kullanıldığı(mikrobiyoloji için-for microbiology- gibi),
· Bileşiminde bulunan maddelerin isimleri(kazein, pepton, glikoz, agar gibi),
· Bileşiminde bulunan maddelerin g/lL olarak miktarları yani tipik bileşimi,
· Bir litre besi yeri için ne kadar tartım yapılacağı,
· Sterilizasyonunun nasıl ve kaç ºC’ta yapılacağı,
· Belli sıcaklıkta olması gereken pH’sı(25 ºC’ta pH:7,0 gibi ),
· Saklama koşulları (ÖR:15 – 25 ºC’ta ağzı kapalı ve kuru olarak)
Besiyeri Kalite Kontrolü
Besiyeri üreten firmalar, ürettikleri ve pazarladıkları dehidre besiyerleri, hazır besiyerleri ve katkılarını sistematik olarak kalite kontrolden geçirmektedirler. ISO 11133 sayılı standart üretici firmanın yükümlülüklerini belirlemektedir.
Dehidre besiyerleri, bileşenleri ve katkılarını kullananlar için ilave kontrol uygulamalarına genellikle gerek duyulmaz. Buna karşın, -özellikle kuşku duyulmayı gerektirecek bir durumla karşılaşıldığında- aşağıdaki kontrollerin kullanıcılar tarafından yapılması yararlı olacaktır:
· Önce, orijinal ambalajın fiziksel olarak zarar görmemiş olduğu kontrol edilir. Kapak açıldıktan sonra renkte anormallik, topaklaşma gibi kontroller yapılır.
· Laboratuvarda sık kullanılan dehidre besiyerleri için, halen kullanılmakta olan kutudan son parti besiyeri hazırlanırken yeni kutunun açılması, bu kutudan da yeteri miktarda besiyeri hazırlanması, ekimlerin her iki grup besiyerinde beraberce (paralel) yapılması ile bir anlamda yeni kutu için kalite kontrol yapılmış olur. Her iki grupta, istatistik olarak analiz yapılmak üzere birbirlerinden farksız sonuç alınması gerekir.
· Aynı uygulama besiyeri katkıları için de yapılmalıdır.
· Besiyeri üreten firmalar tarafından hazırlanan kataloglarda hangi besiyerinde hangi mikroorganizmaların nasıl gelişeceği "kalite kontrol mikroorganizmaları" adı altında gösterilir.
· Besiyerinde kullanıcı tarafından çözülemeyen bir hata kaynağı varsa, öncelikle besiyerini pazarlayan firmayla temas kurulmalıdır.
Besiyeri Hataları
Besiyerlerinde, doğrudan analiz sonucuna yansıyabilecek çeşitli hatalar ile bunların olası nedenleri aşağıda listelenmiştir. Görüleceği gibi; nem almış, yanlış tartılmış, aşırı ısıtılmış, hazırlamasında damıtık su kullanılmamış besiyerlerinde pek çok hata görülmektedir. Bu gibi hatalar gösteren ya da hatalı olduğundan yana kuşku duyulan besiyerleri mikrobiyolojik analizlerde kullanılamaz.
Dehidre besiyerinde topaklaşma: Depolamada aşırı nem, dehidre besiyeri kutu kapağının nemli bir ortamda uzun süre açık kalması ve/veya gevşek kapatılmış olması, besiyerinin çok eski olması.
Yanlış pH: Nötral olmayan su kullanımı, aşırı ısıtma, dehidre besiyerinin çok eski olması, yanlış tartım, pH'nın yanlış sıcaklıkta ölçülmesi, pH metre kalibrasyon hatası, sulandırmadan sonra sterilizasyonun zamanında yapılmaması, yetersiz yıkanmış cam malzeme kullanılması, dehidre besiyerinin nem alması.
Anormal renk: Saf olmayan su kullanımı, kirli cam malzeme, yanlış pH, aşırı ısıtma, hatalı tartım, dehidre besiyerinin çok eski olması.
Besiyerinde kararma: Aşırı ısıtma, dehidre besiyerinin çok eski olması.
Bulanıklık ve presipitasyon: Saf olmayan suyun kullanılması, temiz olmayan cam malzemenin kullanılması, hatalı pH, aşırı ısıtma, bileşimden hazırlanmış besiyerlerinde temel bileşen(ler)'in yeterli saflıkta olmaması, hazırlanmış besiyerinde depolama sırasında nem kaybı, dehidre besiyerinin çok eski olması.
Yüksek jelleşme sıcaklığı: Hatalı tartım, uygun olmayan agar kullanılması.
Zayıf jelleşme stabilitesi: Hatalı tartım, dehidre besiyerinin tam çözülmeden dağıtılmış olması, düşük pH, asidin besiyeri çok sıcakken ilave edilmesi, aşırı ısıtma, erimiş halde uzun süre ile su banyosunda bekletme.
Zayıf gelişme: Yetersiz yıkanmış ve/veya durulanmamış cam malzemeden inhibitör madde kontaminasyonu, hatalı pH, besiyeri ve katkılarının hatalı tartımı ve/veya hatalı ilavesi, aşırı ısıtma, dehidre besiyerinin çok eski olması.
Aşırı gelişme: Selektif inhibitörlerin bozulacağı kadar aşırı ısıtma veya selektif katkıların yüksek sıcaklıkta bazal besiyerine ilavesi, selektif inhibitörlerin eksik tartımı/ilavesi, inhibitör içeren besiyerlerinde standart dışı uzun süre depolama.
Kolonilerin yayılması: Besiyeri yüzeyinin çok ıslak olması, selektif inhibitörlerin bozulacağı kadar yüksek sıcaklıkta katkı ilavesi.
Atipik gelişme: Besiyerinin hatalı hazırlanması, dehidre besiyerinin çok eski olması, hazırlanmış besiyerinin uygun olmayan koşullarda ve/veya uzun süreli depolanması, cam malzeme ve/veya sudan çeşitli inhibitörler ve/veya yabancı maddelerin kontaminasyonu.
Diatek tarafından satın alabileceğiniz Hazır besiyerleri ve Toz besiyerleri analizlerinizde başarılı sonuçlar almanızı sağlar.
aLinti..