Bu forumdaki linkleri ve resimleri görebilmek için en az 25 mesajınız olması gerekir.
Salmonella spp. Aranması
1. AMAÇ ve KAPSAM
Tüm gıda numunelerinde Salmonella spp. aranması amacını taşır.Salmonella spp; Entrobacteriaceae familyasında yer alan, gram negatif, fakültatif anaerob, spor yapmayan kısa çubuk şeklindeki bakterilerdir. Patojen enterik mikroorganizma olup, ateş, septisemi ve gastro-enterisite neden olur. Riskli gıdalar, kümes hayvanlarının etleri yumurta ve yumurta ürünleri, krema, salatalar, soslar ve süt ürünleridir.
METOT 1
2. PRENSİP
Gıdalarda enterobacteriaceae familyası veya diğer familya üyelerinin baskısı altında bulunan salmonella spp. bakterilerinin saptanması seçici olmayan sıvı ortamlarda ön zenginleştirme, seçici ortamlarda zenginleştirme, tanımlama ve doğrulama testleriyle kesin olarak saptanması ilkesine dayanır.
3. Alet ve Ekipmanlar
Otoklav
Sterilizatör ( 160+5 oC)
İnkübatörler (35+1oC, 42+1oC)
Analitik teraziler (0.01g hassasiyette)
Su banyosu (80-100 oC)
Stomacher
pH metre
Bunzen beki
Steril bıçak, pens,spatül,
vb. malzemeler
Tüp karıştırıcı
Plastik steril petriler (15x90mm )
Otomatik pipet ve steril pipet ucu
Cam tüpler ve tüp sporlar
Erlen ,beher,mezür
vb. standart laboratuvar cam malzemesi
Mikrodalga
4. Kullanılan Besiyerleri
BUFFERED PEPTONE WATER:
Formül:
Enzymatic digest of casein : 10 g
NaCl : 5 g
Na2HPO4.12H2O : 9 g
KH2PO4) : 1,5 g
Distile su : 1000 ml
Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. 121oC’de15 dakika otoklav edilir.pH 7,0+0,2 olacak şekilde ayarlanır.
RAPPAPORT-VASİLLADİS SOYA BROTH (RVS)
Formül :
Enzymatic digest of soya : 5 g
NaCl : 8 g
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4): 1,4 g
Dipotasssium hydrogen phosphate : 0,2 g
Magnesium ghloride.6H2O : 1,6 g
Malachite gren : 0,04 g
Distile su : 1000ml
Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür ve tüplere 10 ml olarak bölünür. 115oC’de 15 dakika otoklav edilir. Sonunda pH 5,2+0,1 olacak şekilde ayarlanır.
MULLER-KAUFFMANN TETRATHİONATE-NOVOBİOCİN BROTH (MKTTn)
Formül :
Meat extract : 4,3 g
Enzymatic digest of casein : 8,6 g
NaCl : 2,6 g
Calcium carbonate (CaCO3) : 38,7 g
Sodium thiosulfate pentahydrate : 47,8 g
Bakteriyolojik safra : 4,78 g
Brillant green : 9,6
Distile su : 1000ml
Tartılan hazır besiyeri içeriği erimesi için 5 dakika su içinde bekletilir. Gerekiyorsa pH 8,2+ 0,2 Olarak ayarlanır.
İodine-iodide solüsyonu
İyot : 20 g
Potasyumiyodür (KI) : 25 g
Distile su :100 ml
Potasyum iyodür 10ml su ile çözündürülür. İçerisine iyot da eklenir ve 100 ml’ye tamamlanır. Güneşe karşı korumanı bir kapta saklanır.
Novobiocin solüsyonu
Novobiocin sodyum salt : 0,04 g
Distile su :5 ml
Novobiocin su ile çözündürülür. Filitrasyon yöntemiyle sterilize edilir.3oC+2 oC’de saklanır.
Aseptik koşullarda 1000ml hazırlanan besiyeri içeriğine, 20 ml iodine- iodide solusyonu, 5 ml novobiocin solüsyonu karıştırılarak tüplere 10 ml olacak şekilde bölünür.
XYLOSE LYSİNE DEOXYCHOLATE AGAR (XLD AGAR)
Formül :
Yeast extract : 3 g
NaCl : 5 g
Xylose : 3,75 g
Lactose : 7,5 g
Sucrse : 7,5 g
L-Lysine hydrochloride : 5 g
Sodyum thiosulfate : 6,8 g
Iron (III) amonyum citrate : 0,8 g
Phenol red : 0,08 g
Sodyum deoxycholate : 1 g
Agar : 9 veya18 g
Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile kaynatarak eritilir. Otoklav edilmez. Sonunda pH 7,4+0,2 olacak şekilde ayarlanır. 45-50 oC de petrilere dökülür.
BRİLLAND GREEN AGAR
Formül :
Proteose peptone : 10g
Yeast extract : 3 g
Lactose : 10 g
Sucrse : 10g
Sodyum chloride : 5 g
Phenol red : 0,08 g
Brillant green : 0.0125g
Agar : 12g
Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile kaynatarak eritilir. Otoklav edilmez. Sonunda pH 6,9+0,2 olacak şekilde ayarlanır. 45-50 oC de petrilere dökülür.
4.1 Kullanılan Biyokimyasal ve Serolojik Test Besiyerleri
(istenirse hazır biyokimyasal test kitleri kullanılabilir)
NUTRIENT AGAR
Formül :
Meat extract : 3 g
Peptone : 5 g
Agar : 9 veya18 g
Distile su : 1000 ml
Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. 121oC’de 15 dakika otoklav edilir. pH 7,0+0,2 olacak şekilde ayarlanır. 45-50 oC’de petri kutularına dökülür.
TRİPLE SUGAR/İRON AGAR (TSI)
Formül :
Meat extract : 3 g
Yeast extract : 3 g
Peptone : 20 g
NaCl : 5 g
Lactose : 10 g
Sucrose : 10 g
Glucose : 1 g
İron (III) citrate : 0,3 g
Sodyum thiosülfate : 0,3 g
Phenol red : 0,024 g
Agar : 9 veya18 g
Distile su : 1000 ml
Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. pH 7,4+0,2 olacak şekilde ayarlanır. 10 ml olarak tüplere bölünür. 121oC’de 15 dakika otoklav edilir. 2,5-5 cm derinlik oluşturacak şekilde tüpler yatırılarak yatık tüp besiyeri oluşturulur.
UREA AGAR
Formül :
Peptone : 1 g
Glucose : 1 g
NaCl : 5 g
KH2PO4 : 2 g
Phenol red : 0,012 g
Agar : 9 veya18 g
Distile su : 1000 ml
Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür. 121oC’de 15 dakika otoklav edilir. pH 7,0+0,2 olacak şekilde ayarlanır.
Ürea solusyonu
Urea : 400 g
Distile su 1000 ml’ye tamamlanır.
Flitrasyon yöntemiyle sterilize edilir.
Hazırlanan besiyeri içeriği :950 ml
Urea solusyonu : 50 ml
Hazır besiyeri içeriğine sterilizasyondan sonra 44 oC’de ürea solusyonu eklenir ve asptik koşullarda 10 ml olarak tüplere bölünür. Yatık tüp besiyeri olarak soğutulur.
L-LSİNE DECARBOXYLATİON
Formül :
L-Lysine monohydrochloride : 5 g
Yeast extract : 3 g
Glucose : 1 g
Bromocresol purple : 0,015 g
Distile su : 1000 ml
Tartılan besiyeri içeriği ısıtılarak çözündürülür. 2 ml yada 5 ml olarak tüplere bölünür. 121oC’de 15 dakika otoklav edilir.
β- GALACTOSİDASE AYIRACI
Formül :
Buffer solusyonu:
Sodyum dihydrgen phosphate (NaH2PO4) : 6,9 g
Sodyum hydroxide, 10 mol/l solusyon : 3 ml
Tartılan karışım sonunda distile 50 ml’ye tamamlanır. pH 7,0+0,2
ONPG solusyonu:
o-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) : 0,08 g
Distile su : 15 ml
50oC’de distile su ile çözündürülür. Soğutulur.
Toplam karışım:
Buffer solusyonu : 5 ml
ONPG solusyonu : 15 ml
MR-VP BROTH
Formül :
Peptone : 5g
Glukose : 5g
Phosphate buffer : 5g
Distile su : 1 litre
Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür.10 ml olarak tüplere bölünür.121oC’de 15 dakika otoklav edilir. Sonunda pH 7,5+0,2 olacak şekilde ayarlanır
VOGES-PROSKAUER (VP) AYIRACI
Formül :SOLÜSYON 1 (Bu çözelti saman sarısı renkte olmalıdır.)
α-naphtol : 5 g
absolute Alkol : 100 ml
Formül :SOLÜSYON 2
potasyum hidroxide : 40 g
distile su : 100 ml
Tryptone broth:
Formül :
Tryptone : 10 g
NaCl : 5 g
DL-Tryptophan : 1 g
Distile su : 1000 ml
Tartılan besiyeri içeriği ısıtılarak çözündürülür. pH 7,5+0,2 olacak şekilde ayarlanır. 5 ml olarak tüplere bölünür. 121oC’de 15 dakika otoklav edilir.
Kovacs ayıracı(hazır olarak temin edilebilir)
4-Dimethylaminobenzaldehyde : 5 g
hydrocloric acid ρ=1,18g/ml yada 1,19 g/ml : 25 ml
2-methylbutan-2-ol : 75 ml
Salmonella O- Vi-H antijeni
5. UYGULAMA
25g (ml) numune 225ml buffered peptonlu su ile aseptic koşullarda homojenize edilir. 37+1 oC 18+2 saat inkübe edilerek zenginleştirme yapılır.
Buffered peptonlu suda ön zenginleştirme yapılan numuneden 0,1ml 10ml olan Rapaport vassililadis medium (RVS)’ye, 1ml de 10ml olan Muller-Kauffman broth (MKTTn) içeren tüplere inoküle edilir. RVS sıvı besiyeri 41,5+1 oC de 24+3 saat , Muller-Kauffman broth (MKTTn) sıvı besiyeri de 37+1oC de 24+3 saat inkübasyon edilerek ikinci bir zenginleştirme yapılır.
İnkübasyon sonunda RVS ve MKTTn’den katı besiyerleri olan XLD agar ve Brillant green phenol red agar’a geçilir. 37+1oC de 24+3 saat inkübe edilir. İnkibübasyon sonucu Birillant green phenol red agardaki Salmonella spp. için tipik koloniler; pembe-kırmızı nadiren renksiz renkte, çevrelerinde kırmızı bir zon oluşturarak üreme gösterirler. XLD agar ortamında ise koloniler merkezleri siyah pembe koloniler oluştururlar.
İdentifikasyon için XLD agar ve BGPR agar da üremiş olan tipik kolonilerden Nutrient agara geçilir. 37+1oC de 24+3 saat inkübe edilerek zenginleştirilir.
METOT 2
2 . PRENSİP :
Salmonella Hızlı test yöntemi olarak geçen metot hareketli Salmonella ‘ların izolasyonunda kullanılır.Metotda kullanılan Kit, A ve B olarak adlandırılan iki tüp içeren bir kültür kabından oluşmaktadır. Her tüp gözenekli bir yapıyla birbirinden ayrılan, altta seçici , üstte indikatör özellikte bir besiyeri içerir. A tüpünün alt kısmında Modified Rappaport Vassiliadis Medium, üst kısmında Lysine Iron Cystine Neutral Red Medium; B tüpünün alt kısmında Lysine Iron Desoxycholate Medium, üst kısmında Modified Brilliant Green Medium bulunmaktadır. Homojenize edilerek uygun bir ortamda ön zenginleştirmesi yapılmış gıda örneği Salmonella Elective Medium ve A, B olarak belirtilen iki adet tüp içeren kültür kabına inoküle edilir. Salmonella ‘lar alttaki seçici ortamdan, üstteki indikatör ortama aktif olarak hareket ederler ve varlıkları renk değişikliği olarak belirir. Hareketli Salmonella suşlarının Elektive mediumdan seçici indikatör ortamlara geçişi ve gelişmeleri, A tüpünde H2S oluşumuna bağlı siyah renk oluşumu, B tüpünde ise laktoz fermentasyonunun negatif olduğunu gösteren kırmızı renk oluşumu şeklinde gözlenir. Hareketsiz suş olan S. pullorum ve S. gallinarum tipleri ise bu yöntemle saptanamamaktadır.
.3. Alet ve Ekipmanlar
Otoklav
Sterilizatör ( 160+5 oC)
İnkübatörler (35+1oC, 41+1oC)
Analitik teraziler (0.01g hassasiyette)
Su banyosu (80-100 oC)
Stomacher
pH metre
Bunzen beki
Steril bıçak, pens,spatül,
vb. malzemeler
Tüp karıştırıcı
Plastik steril petriler (15x90mm )
Otomatik pipet ve steril pipet ucu
Cam tüpler ve tüp sporlar
Erlen ,beher,mezür
vb. standart laboratuvar cam malzemesi
Mikrodalga
4. Kullanılan Besiyerleri
Buffered Pepton Water
Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür.Balonlara bölünür. 121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir. Buzdolabında saklanır.
Salmonella Rapid Test Elective Medium (SRTEM)
Tartılan hazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtılarak çözündürülür..Balonlara bölünür.121+1oC‘de 15 dakika sterilize edilir. Buzdolabında saklanır.
Salmonella Rapit Test Kiti(Oxoid)
Salmonella Latex Test(Oxoid)
4.1 Kit içeriği
Kültür kapları (beşli poşet içerisinde)
Novobiocin disk
Kapak açma anahtarı
Enjektör ve ucu
Kullanım kılavuzu
5. UYGULAMA
25g örnek 225 ml Buffered Pepton Water içinde homojenize edilir, 35°C’de18 saat inkübasyona bırakılır.
5.1 Kültür Kabının Hazırlanması
18-20˚C’ de kuru ortamda saklanan kültür kapları poşetinden çıkarılır ve kalanların nem almaması için poşet kapatılır. Kültür kabı belirli bir açı altında laboratuar tezgahının kenarlarına vurularak, yapışmış besiyerlerinin kap çeperlerinden ayrılması sağlanır ve kabın kapağı açılır.
Kültür kabının üzerinde işaretlenmiş “1” numaralı seviyeye kadar steril damıtık su konur (yaklaşık 27 ml) Kap içerisinde yer alan A ve B tüplerinin tabanlarının su seviyesinin altında kalıp kalmadığı kontrol edilir.
Kit paketinde yer alan steril enjektörle kültür kabının üzerinde işaretlenmiş “3” numaralı seviyeye kadar A ve B tüplerine su çekilir. Bu işlem yaklaşık 5 saniyede tamamlanmalıdır. Enjektör iğnesinin tüpler içindeki ortamlara değmemesine, tüplerin kap içinde yerlerinden oynamamasına ve kapaklarının gevşememesine dikkat edilmelidir.
Kültür kabının kapağı kapatılır ve kap, tüp karıştırıcı (vorteks mikser
vb.) ile karıştırılır. Burada önemli olan husus tüplerin içindeki sıvının yaklaşık 5 saniye kadar kuvvetlice çalkalanmasıdır. Karıştırma işlemi sonrası kap karıştırıcıdan alınır ve en az 5 dakika dinlendirilir. Dinlendirme süresi 4 saati geçmemelidir.
Kültür kabının kapağı dikkatlice açılır, steril ve oda sıcaklığındaki (18-25°C) Salmonella Rapid Test Elective Medium (SRTEM) kabın geniş haznesi içine “2” numaralı seviyeye kadar boşaltılır.
Bir adet “Novobiocin” diski aseptik koşullarda kültür kabına ilave edilir. Kit paketinde yer alan anahtar ile tüplerin kapakları açılır. Kapakları el yardımıyla açmak da mümkündür. Burada dikkat edilecek nokta, kültür kabının içine veya tüplere doğrudan temastan kaçınılmasıdır. Kültür kabının kapağı kapatılır ve böylece kap kullanıma hazır hale gelir.
Kültür kabının kapağı açılır ve ön zenginleştirme yapılmış kültürden kap içine 1 ml aktarılır. Kültür kabının ağzı kapatılarak 41°C’de 24 saat inkübasyona bırakılır.
5.2 :Sonuçların değerlendirilmesi
24 saatlik inkübasyon süresi sonunda kültür kabı inkübatörden alınır ve iyi ışık alan bir ortamda kap içindeki tüplerin üst kısmındaki indikatör bölümleri renk değişikliği yönünden kontrol edilir (bu işlem asla tüpler kap içinden çıkarılarak yapılmamalıdır). Muhtemel Salmonella varlığı indikatör ortamda renk değişikliğine neden olur (bir tüpte renk değişikliğinin olması bu sonuç için yeterlidir).
TÜP A: İnkübasyon sonrası A tüpünün üst bölmesindeki renk değişimleri ve değerlendirilmeleri aşağıda verilmiştir:
İnkübasyon öncesi alt bölme mavi, üst bölme kırmızıdır.
Negatif sonuç -siyahlaşma yok
Pozitif sonuç: -hafif siyahlaşma
Pozitif sonuç: -kuvvetli siyahlaşma
TÜP B: İnkübasyon sonrası B tüpünün üst bölmesindeki renk değişimleri ve değerlendirilmeleri aşağıda verilmiştir:
Negatif sonuç -değişiklik belirgin değil
3 ve 4. Negatif sonuç -sarı, üstü yeşil
5. Pozitif sonuç -sadece kırmızılaşma
6. Pozitif sonuç -hafif kırmızılaşma ve siyahlaşma
7 ve 8. Pozitif sonuç -kırmızı ve siyah renk oluşumu
Pozitif reaksiyon veren tüplerdeki kültürlere Salmonella Latex Test kullanılarak aglutinasyon testi uygulanmalıdır.Aglutünasyon testinde “POZİTİF”sonuç alınırsa kitin
Aglutinasyon uygulanan bölümünden Salmonella izolasyon besiyerine geçilir ve üreyen kolonilere Metot 1.’de anlatılan doğrulama testleri uygulanır.
KAYNAK; Salmonella Hızlı Test Prosedürü(OXOİD)
aLinti..