[PySSyCaT]

PCR’ ın temel bileşenleri

1- Çoğaltılacak DNA bölge
2- Çoğaltılacak bölgeyi kopyalayacak olan DNA Polimeraz enzimi,
3- Yeni zincirin yapımında kullanılacak olan deoksinükleotid trifosfatlar,
4- DNA Polimeraz enzimi için gerekli olan kimyasal ortamı sağlayan tampon sistemi.


1. Kalıp DNA:
PCR için her türlü kaynaktan temin edilen DNA (veya RNA) kullanılabilir. Çoğaltılacak kalıp DNA’nın diziliminin tam bilinmesi gerekmez. Bir PCR için başlangıç materyali, çoğaltılacak olan baz dizisine sahip genetik materyaldir. Eğer çoğaltılacak materyal olarak RNA’dan faydalanılacaksa, Reaksiyon başlamadan önce RNA, komplementer DNA’ya (cDNA) çevrilir ve sonra da bu cDNA, PCR için bir kalıp olarak görev yapar ve reaksiyona aynen DNA’daolduğu gibi Taq Polimeraz enziminin ortama ilavesiyle devam edilir.

2.Primerler (Oligonükleotidler):
Sentez için basamak oluşturan, DNA’yı PCR tekniği ile çoğaltabilmek için kullanılan, kalıp DNA ile eşleşecek 20-40 bazlık sentetik oligonükleotidlere primer denir. Primerler, denatüre edilmiş DNA molekülünün iki zinciri birbirinden ayrı durumda iken, bu zincirlerin herhangi bir bölgesine komplementler özellikteki küçük bir yabancı DNA parçası eklenirse, bu yabancı DNA dizisi ilgili zincirin tamamlayıcısı olduğu bölgeye yapışır ve bu olaya da hibridizasyon denir

3. Polimeraz Enzimleri:
PCR’ın kullanılmasını sağlayan en önemli faktör enzim DNA polimerazın (Taq Polimeraz) optimum çalışma ısısı 72ºC’dir. 97ºC’ye kadar dahi dayanabilen bu enzim,reaksiyon başlamadan önce ortama ilave edilir ve çoğalma döngülerinin tam bir serisinde aktif olarak reaksiyonu sonlandırabilir.
4. Deoksinukleotid Trifosfot (dNTP) Karışımı:
Nükleik asit ya da yeni DNA sarmallarının sentezlenebilmeleri için; dATP, dTTP, dGTP, dCTP olarak bilinen 4 tip deoksinükleotidtrifosfata (dNTP) gereksinim duyulmaktadır.
5. Mg+2:
Mg iyonu, primer ile DNA arasındaki bağlanmayı ve DNA polimerazın kalıp-primer kopleksi ile birleşerek oluşturduğu replikasyon kompleksini stabilize eder. Mg+2 konsantrasyonu dNTP konsantrasyonundan fazla olmalıdır. Önerilen konsantrasyon aralığı 1-4mM’dır.
6. Tampon çözeltiler:
PCR için uygun tampon 10-50mM arasında değişen Tris HCL’dir. TrisHCl tamponun pH’sı ise 8,3-8,8 arasında değişir. Bu tampona 50mM’lık KCL çözeltisi eklenmesi primerlerin yapışmasını kolaylaştırır. PCR’da kullanılan standart solüsyonlar kısaca; Tris, KCI, MgCl2, Jelâtin ve Tween 20 olarak sıralanabilir.