[PySSyCaT]

Pcr Basamakları

PCR BASAMAKLARI
• Çoğaltılacak DNA denatüre edilerek (94°C’de 5 dakika) tek zincirli hale getirilir.
• Isıya dayanıklı bir DNA Polimeraz olan Taq DNA Polimeraz reaksiyon ortamına ilave edilir. DNA’nın çoğaltılması 72°C’de gerçekleşir.
1. Denatürasyon
- Hedef DNA’nın ilk Denatürasyon çok zor olabilir. Bu sebepten dolayı PCR İşlenme başlamadan önce içerisine Taq DNA Polimeraz katılmamış karışımların Bulunduğu ependorf tüpleri PCR cihazının sıcaklığı 100ºC’de 10 dakika kadar bekletilir. Sonra Taq DNA Polimeraz katılarak normal döngü işlemi başlatılır.
2.Primerle eşleşme (Annealing)
Primer eşleşme ısı aşırısı için en önemli parametredir Her primer için değişken olan karakteristik bir özelliktir.Primerlerin kaç bazdan oluştuğu,baz çeşitliliği ve ortamın iyonik kuvvetinden etkilenir. Teorik olarak hesaplanabilmektedir, fakat en doğru değer deneysel olarak belirlenir. En uygun Tm sıcaklığını belirlemek için gradientli PCR yapılır.
3. Uzama (Extension)
- Uzama safhası genellikle DNA Taq polimerazın en iyi çalıştığı sıcaklık olan72ºC’de gerçekleştirilir.
- Süresi çoğaltılacak hedef DNA’nın uzunluğuna göre ancak genellikle 1-2 dakika yeterlidir.
4. Döngü sayısı
- Döngü sayısı arttıkça ürün miktarı artar.
- Genellikle 25-35 döngü yeterlidir.
- Döngü sayısı çok olduğu zaman spesifik olmayan bağlanmalar olacağından (yanlış ürünlerin) miktarı da artar ve ürün kirlenir.