IRCForumları - IRC ve mIRC Kullanıcılarının Buluşma Noktası
  Mobil Sohbet, Sohbet ve Sohbet Odaları




Yeni Konu aç Cevapla
 
LinkBack Seçenekler Stil
Alt 24 Ekim 2012, 22:54   #1
Zen
Guest
Zen - ait Kullanıcı Resmi (Avatar)
Mikrobiyolojide Temel Yöntemler


sohbet


Hayvanlar ve bitkiler gibi büyük organizmaları çalışan biyologlar, genellikle deneysel materyalleri görebilir, bunların çevrelerinden ve birbirlerinden farklılıklarını ayırt edebilirler . genellikle görme, koklama, işitme hatta dokunma gibi duyularını kullanarak özellikleri belirler ve ayırt ederler. Böylece, büyüme ve gelişmelerindeki değişiklikler takip edilirler . mikrobiyologlar, diğer bilim adamlarından farklı olarak görme dışındaki duyuları kullanamadıklarından genellikle belirli problemlerle karşı karşıya kalırlar. Birincisi, çoğu habitatlar (örneğin, toprak ve ağzınız) mikroorganizmaları karmaşık birliktelikler şeklinde bulundururlar. Bu nedenle, genellikle türleri birbirinden ayırt etmek gerekir. Bunlara ilave olarak, böylesine küçük araştırma objelerini çalıştırmak ve muhafaza etmek için mikrobiyologlar genellikle mikroorganizmaları suni ortam şartlarında büyütürler . mikroplarla çalışmanın üçüncü önemli güçlüğü görünemeyecek kadar küçük ve yaygın olmaları ve istenmeyen mikroorganizmanın deney ortamına girerek yanlış sonuçların ortaya çıkmasına sebep olmalarıdır. Bu güçlükler steril tekniklerin, saf kültürlerin ve asetik tekniklerin geliştirilmeleriyle ortadan kaldırılmıştır.

Mikrobiyologlar mikroorganizmalar mikroorganizmaları çalışmayı, büyütme inceleme ve karakterize etmek için beş temel teknik kullanılır. Bunlar: inokülasyon, inkübasyon, izolasyon, inspeksiyon ve identifikasyondur. Bu prosedürlerin bazıları veya hepsi, ister yeni başlayan mikrobiyoloji öğrencilerisi olsun, ister topraktan antibiyotik üreten bakterileri izole etmeye çalışan araştırmacı olsun, isterse bir hastanın enfeksiyonundan alınan bir örnek ile çalışan bir klinik mikrobiyologu olsun bütün mikrobiyologlar tarafından kullanılmaktadır. Bu prosedürler mikroorganizmaların biyolojilerini çalışmak ve kaydetmek için yaygın olarak kullanılır.

1. İNOKÜLASYON VE İZOLASYON

Mikroorganizmaları çoğaltmak veya kültür yapmak için küçük bir mikroorganizma örneği (inokülüm) besiyeri olarak isimlendirilen içerinde besinler bulunan birkaba aktarılır. Bu prosedür inokülasyon olarak adlandırılır. Besinleri üzerinde veya içerisinde görülebilir mikrobiyal büyüme kültür adını alır. Kültür edilen örneğin özelliği analiz amacına bağlıdır. Bir enfeksiyon hastalığının sebebini belirlemeyi amaçlayan klinik örnekleri vücut sıvılarından ( kan , beyin omurilik sıvısı), atıklardan ( tükürük, idrar;feçes) veya hastalıklı dokulardan alınabilir. Mikrobiyolojik analizler için kullanılan diğer örnekler toprak, su, artık su, besinler, hava ve cansız objeler olabilirler. Örnek alma prosedürleridaha sonraki konularda tartışılacaktır.

Tüp, flask veya petri kapları içersinde kapları içersinde bulunan kültür besiyerileri öze, iğne, sıvab ve pipet ile inoküle edilirler. Besiyeriler, besin içeriği ve kıvamı bakıldığından aşırı derecede çeşitlilik gösterir. Ayrıca, özel amaçlar için formüle edilebilirler. Yapay besinler üzerinde büyüyemeyen zorunlu parazitlerin (virüs ve bakteriler) kültür edilmeleri canlı hücre kültürleri veya konak hayvanlarına ihtiyaç gösterir. Bir deneyin arzu edildiği gibi kontrolü için steril teknikler gereklidir( Bu teknikleri başka bir başlık altında zaten anlatmıştım). Bu, inokülasyonun steril bir besiyeri ile başlaması ihtiyacını göstermektedir. Kullanılan inokülasyon aletleri de steril olmak zorundadır. Parmak dokunması veya laboratuarın havasının kültüre direkt olarak temas etmemesi için itina gösterilmelidir.

Saf kültür içerisinde bilinen tek bir tür veya tip mikroorganizmanın büyüdüğü kültürdür. Laboratuar çalışmaları için genellikle bu tip kültürler kullanılır. Çünkü bu, kontrollü inceleme ve karışık sonuçların oluşmamasına imkan verir. Bazı mikrobiyologlar saf kültür yerine arsenik sözcüğünü kullanmaktadır. Bunun manası kültürün çalışılması istenilen organizma dışında başka organizmalar içermemesidir. Karışık kültür iki vaya daha fazla kolaylıkla ayırt edilebilen belirli mikroorganizmayı ihtiva eden kültürdür. Kontamine olmuş kültür, saf veya karışık kültür oluşturulurken buna istenmeyen organizmalaın girmeleridir. Kontaminantlar işleri bozucular olduklarından mikrobiyoloji laboratuarlarından uzaklaştırmak için sürekli itina gösterilmelidir.

Hücreleri İzole Etme Teknikleri

İzolosyon tekniklerinin esası bir bakterinin diğer bakterilerden ayrılması, besiyeri üzerinde uygun bir yerde bulunması ve koloni olarak isimlendirilen bir kitle oluşturulmasına bağlıdır. Koloni, tek bir hücreden oluştuğundan, tek bir türü içerir ve içerisinde başka organizmalar bulunmaz. Uygun izolosyon az sayıda hücrenin nisbeten geniş sahalı besiyeriye (Petri kabı; şeffaf kapaklı plastik veya cam bir kap) ve inokülasyon özesine ihtiyaç duyulur. Çizgi ekim metodunda, küçük bir damla kültür veya örnek besiyerinin yüzeyine yayılır. Bu hücreleri seyreltmek ve birbirlerinden ayırmak için özenin farklı bölgeler üzerine sürülmesiyle olur. Etkili ve ekonomik olmasından dolayı, çoğu uygulamalar için en iyi yöntem çizgi ekimdir.

Öze seyreltme veya dökme kap tekniklerinde, örnek seri olarak steril tüp agar besiyerleri içerisine inoküle edilir. Böylece serideki her art arda gelen tüplerdeki hücrelerin sayıları seyreltilmiş olur. İnoküle edilmiş tüpler daha sonra petri kaplarına dökülür ve katılaşması için bekletilir. Sonuç olarak genellikle ikinci ve üçüncü petrilerde hacim başına düşen bakteri sayısı azalmış olur. Böylece hücreler birbirlerinden ayrı koloniler oluşturabilecek yer bulurlar. Bu ve çizgi ekim arasındaki ana farklılık kolonilerin bazıları hemen yüzey yerine besiyerinin içerisinde gelişecektir.


2. MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARLARINDA BESİNLERİN KULLANILMASI

Mikrobiyolojinin gelişmesinin ana sebebi mikropların tabii habitatları dışındaki yerlerde büyütülme tekniklerinin geliştirilmesi ve laboratuarda saf formda geliştirilmeleri olmuştur. Bu gelişmeler mikropların morfoloji, ----oloji ve genetiklerini yakından inceleme imkanları oluşturmuştur. İlk dönemlerde bile başlarda başarılı kültivasyon için mikroorganizmaların ihtiyaç duydukları bütün besinlerin yapay besiyeri içerisinde bulunması gerektiği tespit edilmiştir.

Mikroorganizmalar besin ihtiyaçları çok basit inorganik bileşiklerden karmaşık organik ve inorganik maddelere kadar çeşitlilik göstermektedir. Hazırlanabilecek besiyerlerin çeşitliliğinde olağan üstü derecede değişmeler olabilir. Örneğin, DIFCO katalogu madern mikrobiyoloji laboratuarlarında kullanılan 500'ün üzerinde besiyeri listelenmektedir. Çoğu moders besiyeri önceden hazırlanmış, ticari olarak toz halinde satılan besiyerilerinden yapılır.

Besiyeri Türleri

Besiyeriler üç temel aşamada sınıflandırılır: (1) fiziksel form, (2) kimyasal kompozisyon, (3) fonksiyonel tip. Burada tartışılan besiyerilerin çoğu, alg ve bazı protozoalar da içlerinde üreyebilmelerine rağmen bakteri ve funguslar için dizayn edilmişlerdir.

Besiyerlerin Fiziksel Özellikleri

Sıvı besiyeri su-ilaveli solüsyonlar olarak tanımlanıp, donma sıcaklığının üstündeki sıcaklıklarda sıvı halde kalan ve şişe veya tüp eğildiği zaman serbestçe boşalabilen besiyerleridir. "Broth, süt, infüzyon" gibi sıvı besiyerler çeşitli maddelerin distil su içerisinde çözülmeleriyle yapılır. Büyüme kültür kabı içerisinde olur ve homojen bulanık bir görüntü oluşturur. Yaygın laboratuar besiyerlerinde olan "nutrient broth" su içerisinde et ekstresi ve pepton'un çözülmesiyle oluşur. "Methylene blue milk" ve "litmus milk" mat renkli sıvılar olup süt ve boya içerirler. Sıvı tiyoglikolat, hafif viskoz özellikte oksijenli ortamda büyüme şeklini belirlemek için kullanılır.

Normal oda sıcaklığında, yarı katı besiyeri pıhtı şeklinde bir görünüm oluşturur. çünkü bu besiyer ihtiva ettikleri sertleştirici madde (agar veya jelatin)'lerden dolayı hefif katılaşır, fakat katı bir substrat oluşturmazlar. Yarı katı besiyerler bakterilerin hareketliliklerini ve bir reaksiyonun belli bir yerde lokalize olmaları için kullanılırlar. Hem hareketlilik test besiyeri hem de SIM düşük miktarda (%0.3-0.5) agar ihtiva eder. Besiyeri dikkatli bir şekilde merkezden iğne ile inoküle edilir ve daha sonra iğne çizgisi etrafındaki büyüme şekline dikkat edilir. SIM, bakteri identifikasyonunda kullanılan ----olojik özellikleri (hidrojen sülfür üretimi ve indol reaksiyonu) test etmek için kullanılır.

Katı besiyeri hücrelerin üzerinde koloni oluşturabileceği düz bir yüzey sağlayan besiyerilerdir. Katı besiyerler hem bakterilerin hem de fungusların izolasyon ve supkültür edilmeleri için kullanılır. Genellikle eritilebilen ve eritilemeyen olmak üzere ikiye ayrılır. Eritilemeyen katı besiyerler bazen reverzibıl katı besiyeri olarak adlandırılırlar ve termoplastik (fiziksel özelliği ısı ile değişebilen) bir katılaştırıcı madde ihtiva ederler. Şu ana kadar en yaygın kullanılan ve en etkili alanı agardır. Agar bir kırmızı alg olan Gelidium'dan izole edilen kompleks bir polisakkarittir. Agarın sayısız faydaları vardır. Oda sıcaklığı ve inkübasyon sıcaklıklarında katı olmasına rağmen, suyun kaynama derecesinde (100 C) erir. Agar eridikten sonra, 42 C'ye kadar soğutulmadıkça tekrar katılaşmaz. Bu yüzden, agar sıvı formda (45-50 C) inoküle edilebilir ve sıvı şekilde dökülebilir. Bu sıcaklık mikroorganizmalara veya elinize bir zarar vermez. Agar elastiki ve şekillendirilebilir bir besin olarak iş görmelerine rağmen, nem ve besinler için bir tutunma yeri olarak iş görür.

%1-%5 arasında agar ihtiva eden herhangi bir besiyeri agar olarak isimlendirilir. Nutrient agar en yaygın olanlarındandır. Tıpkı nutrient broht'ta olduğu gibi et ekstresi ve pepton içerir. Bunlara ilave olarak ayrıca ağırlıkça %1.5 oranında agar ihtiva eder fonksiyonel kategorideki besiyerlerin çoğu agar içerir. Jelatin, agar kadar kullanışlı olmamasına rağmen %10-15'lik konsantrasyonlarda nisbeten katı bir yüzey oluşturur.

Eritilemeyen katı besiyeriler, termoplastik olmadıklarından agar besiyerinden daha az uygulama yerlerine sahiptirler. Pirinç tanesi (fungusların büyütülmesi için kullanılır), pişmiş et besiyeri (anaeoroplar için kullanılır) ve patates dilimleri gibi materyalleri ihtiva eder. Bu besiyerilerin hepsi de katı olarak başlar ve ısı sterilizasyonu sonrasında da katı kalır. Yumurta ve serum ihtiva eden diğer bazı katı besiyeriler sıvı bir şekilde başlar ve daha sonra katılaşır veya buharlı ısıyla katılaşır.

Besiyerlerin Kimyasal Muhteviyatı

İçerisiği kimyasal olarak tanımlanmış besiyerilere sentetik besiyeriler adı verilir. Saf organik ve inorganik bileşikler içeren besiyeriler bir kaynaktan bir başka kaynağa göre çok az farklılık gösterir. Çünkü muhteviyatları özel formülerle belirlenir. Sentetik besiyeriler değişik şekillerde bulunurlar. Örneğin, funguslar için kullanılan minimal besiyeri tuzlar ve suda çözülen amino asitler gibi sadece birkaç esansiyal bileşik içerir. Besiyeri bileşiklerinden tek bir tanesi bile kimyasal olarak tanımlanamıyorsa bu besiyeri bir kopleks ve nonsentetik besiyeridir.

Kompleks ve nonsentetik besiyeri, kimyasal bakımdan en az bir tanımlanamayan madde içeren besiyerilerdir. Bu meddelerin çoğu hayvan, bitki veya maya ekstresi olup, hücre doku veya salgılarının öğütülmesi ile oluşturulur. Kan, serum, et ekstresi (infüzyon) bunlara bazı örneklerdir. Diğer sentetik olmayan katı maddeleri ise, süt, maya ekstresi, soya fasülyesi ekstresi ve pepton'dur. Pepton kısmen sindirilmiş protein olup amino asit bakımından oldukça zengindir. Genellikle karbon ve azot kaynağı olarak kullanılır. Nutrient broht, kan agar ve MacConkey agar fonksiyon ve görünüş olarak farklı olmasına ramen, hepsi de sentetik olmayan besiyerilerdir. Kompleks besin ihtiyaçları olan mikroplar için zengin besin karışımı oluştururlar.

Her Amaca Uygun Besiyeriler

Mikrobiyologlar pek çok amaç için kullanılan çeşitli besiyerilere sahiptir. İlave edilen maddeye bağlı olarak, bir mikrobiyolog besiyeriyi her hangi bir amac için modifiye edebilir.

Genel amaç besiyerleri, mümkün oldukça fazla geniş spektrumda mikroorganizmanın büyüyebileceği şekilde dizayn edilmiştirler. Bu besiyerilere örnek olarak nutrient agar, nutrient broht, brain- heart infüzyon ve tryticase soy agar (TAS)'ı verebiliriz. TAS kısmi parçalanmış süt proteini (kazein), soya fasulyesi ekstresi, NaCl ve agar içerir.

Zenginleştirilmiş besiyeri kan, serum, hemoglobin veya özel büyüme faktörleri (vitamin, amino asid) gibi özel bir türün büyümesini destekleyen maddeleri içeren besiyerilerdir. Büyüme faktörü veya karmaşık besinlere ihtiyaç olan bakteriler kompleks bakteriler olarak isimlendirilirler. Steril koyun, at veya tavşan kanına agar ilave edilerek hazırlanan kan agar besiyeri Fastidious streptococci ve pek çok diğer patojenleri büyütmek için kullanılmaktadır. Patojenik Neisseria( bir türü bel soğukluğuna sebep olur) Thayer-Martin besiyeri veya kan agarın ısıtılması ile hazırlanan çikolata agar üzerinde büyütülür.

Seçici ve Ayırt Edici Besiyeriler

Zekice hazırlanmış bazı önemli besiyerler seçici ve ayırt edici besiyeriler kategorisine girer. Bir basamakta bir cins hatta bir türün ilk identifikasyonuna imkan sağlanır.

Seçici besiyeriler façes, tükürük, deri, su ve toprak gibi farklı pek çok türü içeren örneklerden özel bir tip mikroorganizmanın primer izolasyonunda oldukça önemlidir. İzolasyonu istemeyen organizmayı baskılayarak arzu edilen organizmanın büyümesini teşvik ederek yapar.
Monitol salt agar (MSA) %7.5'lik NaCl içerir. Bu konsantrasyondaki tuz Staphylococcus cinsi hariç çoğu insan patojenlerinin büyümelerini engeller. Staphylococcus bu besiyeriüzerinde iyi bir şekilde büyür, bu yüzden oldukça karışık örnekler içerisinden seçilerek çoğaltılır. Façes bileşiklerinden olan "bile salt"ları pek çok gram olumlu bakterinin büyümesini engellerken gram olumsuz çomak şekilli bakterilerin büyümelerine izin verir. Bağırsak patojenlerinin izolasyonu için kullanılan besiyeriler (MacConkey agar, eozin-metilen blue ( EMB ) seçici madde olarak "bile tuz" içerirler. Metilen mavisi ve kristal violet gibi boyalar aynı zamanda gram-olumlu bakterilerin büyümesini engellerler. Selenit ve brillant yeşil boyası façesten salmonella izolasyonu için, sodyum asid ise su ve besinlerde enterokokküsleri izole etmek için kullanılır.

Farklılaştırıcı besiyeriler, çeşitli mikroorganizmaların büyümelerini sağlarken, bu mikroorganizmaların görünür farklılıklarını ortaya çıkarır. Ayırt etme koloni büyüklüğü ve rengi, besiyeri renginin değişmesinde ve gaz kabarcıkları ve çözeltilerin oluşması şeklinde görülür. Bu değişiklikler besiyerilerinin içeriği maddelerden ve mikroorganizmaların bu maddeler ile olan ilişkilerinden kaynaklanır. Örneğin, bir madde X organizması tarafından kulanılıyor. Y organizması tarafından kullanılmıyor olsun. Böylece X organizması besiyeride gözlenebilir değişiklik oluştururken, Y organizması değişiklik oluşturmaz. En basit ayırt edici besiyeri, özel bir maddenin kullanılması ile iki farklı reaksiyon gösterir. Bazı besiyeriler ise üç veya daha fazla reaksiyon gösterebilir (örneğin TSIA, triple-sugar iron agar).

Boyaların pek çoğu pH indikatörleri olduklarından ve asid ve baz üretimine karşı renk değişiklikleri oluşturduklarından ayırt edici madde olarak kullanılır. Örneğin, MacConkey agar nötral durumlarda sarı, asidik durumlarda ise pembe veya kırmızı renk oluşturan nötral kırmızı boyası ihtiva eder.

Muhtelif Amaçlı Besiyeriler

İndirgeyici besiyeriler, oksijeni absorplayan veya besiyeri oksijeninin peretrasyonunu yavaşlatan bir madde (thioglycollic asit veya sistein) içeren veya oksijen ihtiyacının test edilmesi için kullanılır. Karbonhidrat fermentasyon besiyeri fermentlenebilecek (asitlere dönüşebilecek) şekerler ve bu reaksiyonu gösteren bir pH indikatörü içeren besiyerileridir.

Taşıma besiyerileri, örneklerin klinik analizlerinden önce özellikleri bozulmadan muhafaza edildikleri veya taşındıkları besiyerilerdir. Stuarts ve Amies taşıma besiyerleri tuzlar, tamponlar ve absorbantlar içerir. Bunlar hücrelerin enzimler, pH değişmeleri, toksik materyaller tarafından tahrip olmalarını önler, fakat büyümeyi desteklemez. Test besirerileri antimikrobiyal maddelerin etkilerini test etmek, dezenfektant, antisepsis, kozmetik ve mikroorganizmalardan koruyucu maddelerin etkilerini belirlemek için kullanılan besiyerilerdir. Sayım besiyerileri süt, su, besin, toprak ve diğer örneklerdeki mikroorganizmaların sayısını belirlemek için endüstri veya diğer örneklerdeki mikroorganizmaların sayısını belirlemek için endüstri veya çevra mikroorganizmaları tarafından kullanılan besiyerilerdir.

Hayvanlar ve bitkiler gibi büyük organizmaları çalışan biyologlar, genellikle deneysel materyalleri görebilir, bunların çevrelerinden ve birbirlerinden farklılıklarını ayırt edebilirler . genellikle görme, koklama, işitme hatta dokunma gibi duyularını kullanarak özellikleri belirler ve ayırt ederler. Böylece, büyüme ve gelişmelerindeki değişiklikler takip edilirler . mikrobiyologlar, diğer bilim adamlarından farklı olarak görme dışındaki duyuları kullanamadıklarından genellikle belirli problemlerle karşı karşıya kalırlar. Birincisi, çoğu habitatlar (örneğin, toprak ve ağzınız) mikroorganizmaları karmaşık birliktelikler şeklinde bulundururlar. Bu nedenle, genellikle türleri birbirinden ayırt etmek gerekir. Bunlara ilave olarak, böylesine küçük araştırma objelerini çalıştırmak ve muhafaza etmek için mikrobiyologlar genellikle mikroorganizmaları suni ortam şartlarında büyütürler . mikroplarla çalışmanın üçüncü önemli güçlüğü görünemeyecek kadar küçük ve yaygın olmaları ve istenmeyen mikroorganizmanın deney ortamına girerek yanlış sonuçların ortaya çıkmasına sebep olmalarıdır. Bu güçlükler steril tekniklerin, saf kültürlerin ve asetik tekniklerin geliştirilmeleriyle ortadan kaldırılmıştır.

Mikrobiyologlar mikroorganizmalar mikroorganizmaları çalışmayı, büyütme inceleme ve karakterize etmek için beş temel teknik kullanılır. Bunlar: inokülasyon, inkübasyon, izolasyon, inspeksiyon ve identifikasyondur. Bu prosedürlerin bazıları veya hepsi, ister yeni başlayan mikrobiyoloji öğrencilerisi olsun, ister topraktan antibiyotik üreten bakterileri izole etmeye çalışan araştırmacı olsun, isterse bir hastanın enfeksiyonundan alınan bir örnek ile çalışan bir klinik mikrobiyologu olsun bütün mikrobiyologlar tarafından kullanılmaktadır. Bu prosedürler mikroorganizmaların biyolojilerini çalışmak ve kaydetmek için yaygın olarak kullanılır.

1. İNOKÜLASYON VE İZOLASYON

Mikroorganizmaları çoğaltmak veya kültür yapmak için küçük bir mikroorganizma örneği (inokülüm) besiyeri olarak isimlendirilen içerinde besinler bulunan birkaba aktarılır. Bu prosedür inokülasyon olarak adlandırılır. Besinleri üzerinde veya içerisinde görülebilir mikrobiyal büyüme kültür adını alır. Kültür edilen örneğin özelliği analiz amacına bağlıdır. Bir enfeksiyon hastalığının sebebini belirlemeyi amaçlayan klinik örnekleri vücut sıvılarından ( kan , beyin omurilik sıvısı), atıklardan ( tükürük, idrar;feçes) veya hastalıklı dokulardan alınabilir. Mikrobiyolojik analizler için kullanılan diğer örnekler toprak, su, artık su, besinler, hava ve cansız objeler olabilirler. Örnek alma prosedürleridaha sonraki konularda tartışılacaktır.

Tüp, flask veya petri kapları içersinde kapları içersinde bulunan kültür besiyerileri öze, iğne, sıvab ve pipet ile inoküle edilirler. Besiyeriler, besin içeriği ve kıvamı bakıldığından aşırı derecede çeşitlilik gösterir. Ayrıca, özel amaçlar için formüle edilebilirler. Yapay besinler üzerinde büyüyemeyen zorunlu parazitlerin (virüs ve bakteriler) kültür edilmeleri canlı hücre kültürleri veya konak hayvanlarına ihtiyaç gösterir. Bir deneyin arzu edildiği gibi kontrolü için steril teknikler gereklidir( Bu teknikleri başka bir başlık altında zaten anlatmıştım). Bu, inokülasyonun steril bir besiyeri ile başlaması ihtiyacını göstermektedir. Kullanılan inokülasyon aletleri de steril olmak zorundadır. Parmak dokunması veya laboratuarın havasının kültüre direkt olarak temas etmemesi için itina gösterilmelidir.

Saf kültür içerisinde bilinen tek bir tür veya tip mikroorganizmanın büyüdüğü kültürdür. Laboratuar çalışmaları için genellikle bu tip kültürler kullanılır. Çünkü bu, kontrollü inceleme ve karışık sonuçların oluşmamasına imkan verir. Bazı mikrobiyologlar saf kültür yerine arsenik sözcüğünü kullanmaktadır. Bunun manası kültürün çalışılması istenilen organizma dışında başka organizmalar içermemesidir. Karışık kültür iki vaya daha fazla kolaylıkla ayırt edilebilen belirli mikroorganizmayı ihtiva eden kültürdür. Kontamine olmuş kültür, saf veya karışık kültür oluşturulurken buna istenmeyen organizmalaın girmeleridir. Kontaminantlar işleri bozucular olduklarından mikrobiyoloji laboratuarlarından uzaklaştırmak için sürekli itina gösterilmelidir.

Hücreleri İzole Etme Teknikleri

İzolosyon tekniklerinin esası bir bakterinin diğer bakterilerden ayrılması, besiyeri üzerinde uygun bir yerde bulunması ve koloni olarak isimlendirilen bir kitle oluşturulmasına bağlıdır. Koloni, tek bir hücreden oluştuğundan, tek bir türü içerir ve içerisinde başka organizmalar bulunmaz. Uygun izolosyon az sayıda hücrenin nisbeten geniş sahalı besiyeriye (Petri kabı; şeffaf kapaklı plastik veya cam bir kap) ve inokülasyon özesine ihtiyaç duyulur. Çizgi ekim metodunda, küçük bir damla kültür veya örnek besiyerinin yüzeyine yayılır. Bu hücreleri seyreltmek ve birbirlerinden ayırmak için özenin farklı bölgeler üzerine sürülmesiyle olur. Etkili ve ekonomik olmasından dolayı, çoğu uygulamalar için en iyi yöntem çizgi ekimdir.

Öze seyreltme veya dökme kap tekniklerinde, örnek seri olarak steril tüp agar besiyerleri içerisine inoküle edilir. Böylece serideki her art arda gelen tüplerdeki hücrelerin sayıları seyreltilmiş olur. İnoküle edilmiş tüpler daha sonra petri kaplarına dökülür ve katılaşması için bekletilir. Sonuç olarak genellikle ikinci ve üçüncü petrilerde hacim başına düşen bakteri sayısı azalmış olur. Böylece hücreler birbirlerinden ayrı koloniler oluşturabilecek yer bulurlar. Bu ve çizgi ekim arasındaki ana farklılık kolonilerin bazıları hemen yüzey yerine besiyerinin içerisinde gelişecektir.


2. MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARLARINDA BESİNLERİN KULLANILMASI

Mikrobiyolojinin gelişmesinin ana sebebi mikropların tabii habitatları dışındaki yerlerde büyütülme tekniklerinin geliştirilmesi ve laboratuarda saf formda geliştirilmeleri olmuştur. Bu gelişmeler mikropların morfoloji, ----oloji ve genetiklerini yakından inceleme imkanları oluşturmuştur. İlk dönemlerde bile başlarda başarılı kültivasyon için mikroorganizmaların ihtiyaç duydukları bütün besinlerin yapay besiyeri içerisinde bulunması gerektiği tespit edilmiştir.

Mikroorganizmalar besin ihtiyaçları çok basit inorganik bileşiklerden karmaşık organik ve inorganik maddelere kadar çeşitlilik göstermektedir. Hazırlanabilecek besiyerlerin çeşitliliğinde olağan üstü derecede değişmeler olabilir. Örneğin, DIFCO katalogu madern mikrobiyoloji laboratuarlarında kullanılan 500'ün üzerinde besiyeri listelenmektedir. Çoğu moders besiyeri önceden hazırlanmış, ticari olarak toz halinde satılan besiyerilerinden yapılır.

Besiyeri Türleri

Besiyeriler üç temel aşamada sınıflandırılır: (1) fiziksel form, (2) kimyasal kompozisyon, (3) fonksiyonel tip. Burada tartışılan besiyerilerin çoğu, alg ve bazı protozoalar da içlerinde üreyebilmelerine rağmen bakteri ve funguslar için dizayn edilmişlerdir.

Besiyerlerin Fiziksel Özellikleri

Sıvı besiyeri su-ilaveli solüsyonlar olarak tanımlanıp, donma sıcaklığının üstündeki sıcaklıklarda sıvı halde kalan ve şişe veya tüp eğildiği zaman serbestçe boşalabilen besiyerleridir. "Broth, süt, infüzyon" gibi sıvı besiyerler çeşitli maddelerin distil su içerisinde çözülmeleriyle yapılır. Büyüme kültür kabı içerisinde olur ve homojen bulanık bir görüntü oluşturur. Yaygın laboratuar besiyerlerinde olan "nutrient broth" su içerisinde et ekstresi ve pepton'un çözülmesiyle oluşur. "Methylene blue milk" ve "litmus milk" mat renkli sıvılar olup süt ve boya içerirler. Sıvı tiyoglikolat, hafif viskoz özellikte oksijenli ortamda büyüme şeklini belirlemek için kullanılır.

Normal oda sıcaklığında, yarı katı besiyeri pıhtı şeklinde bir görünüm oluşturur. çünkü bu besiyer ihtiva ettikleri sertleştirici madde (agar veya jelatin)'lerden dolayı hefif katılaşır, fakat katı bir substrat oluşturmazlar. Yarı katı besiyerler bakterilerin hareketliliklerini ve bir reaksiyonun belli bir yerde lokalize olmaları için kullanılırlar. Hem hareketlilik test besiyeri hem de SIM düşük miktarda (%0.3-0.5) agar ihtiva eder. Besiyeri dikkatli bir şekilde merkezden iğne ile inoküle edilir ve daha sonra iğne çizgisi etrafındaki büyüme şekline dikkat edilir. SIM, bakteri identifikasyonunda kullanılan ----olojik özellikleri (hidrojen sülfür üretimi ve indol reaksiyonu) test etmek için kullanılır.

Katı besiyeri hücrelerin üzerinde koloni oluşturabileceği düz bir yüzey sağlayan besiyerilerdir. Katı besiyerler hem bakterilerin hem de fungusların izolasyon ve supkültür edilmeleri için kullanılır. Genellikle eritilebilen ve eritilemeyen olmak üzere ikiye ayrılır. Eritilemeyen katı besiyerler bazen reverzibıl katı besiyeri olarak adlandırılırlar ve termoplastik (fiziksel özelliği ısı ile değişebilen) bir katılaştırıcı madde ihtiva ederler. Şu ana kadar en yaygın kullanılan ve en etkili alanı agardır. Agar bir kırmızı alg olan Gelidium'dan izole edilen kompleks bir polisakkarittir. Agarın sayısız faydaları vardır. Oda sıcaklığı ve inkübasyon sıcaklıklarında katı olmasına rağmen, suyun kaynama derecesinde (100 C) erir. Agar eridikten sonra, 42 C'ye kadar soğutulmadıkça tekrar katılaşmaz. Bu yüzden, agar sıvı formda (45-50 C) inoküle edilebilir ve sıvı şekilde dökülebilir. Bu sıcaklık mikroorganizmalara veya elinize bir zarar vermez. Agar elastiki ve şekillendirilebilir bir besin olarak iş görmelerine rağmen, nem ve besinler için bir tutunma yeri olarak iş görür.

%1-%5 arasında agar ihtiva eden herhangi bir besiyeri agar olarak isimlendirilir. Nutrient agar en yaygın olanlarındandır. Tıpkı nutrient broht'ta olduğu gibi et ekstresi ve pepton içerir. Bunlara ilave olarak ayrıca ağırlıkça %1.5 oranında agar ihtiva eder fonksiyonel kategorideki besiyerlerin çoğu agar içerir. Jelatin, agar kadar kullanışlı olmamasına rağmen %10-15'lik konsantrasyonlarda nisbeten katı bir yüzey oluşturur.

Eritilemeyen katı besiyeriler, termoplastik olmadıklarından agar besiyerinden daha az uygulama yerlerine sahiptirler. Pirinç tanesi (fungusların büyütülmesi için kullanılır), pişmiş et besiyeri (anaeoroplar için kullanılır) ve patates dilimleri gibi materyalleri ihtiva eder. Bu besiyerilerin hepsi de katı olarak başlar ve ısı sterilizasyonu sonrasında da katı kalır. Yumurta ve serum ihtiva eden diğer bazı katı besiyeriler sıvı bir şekilde başlar ve daha sonra katılaşır veya buharlı ısıyla katılaşır.

Besiyerlerin Kimyasal Muhteviyatı

İçerisiği kimyasal olarak tanımlanmış besiyerilere sentetik besiyeriler adı verilir. Saf organik ve inorganik bileşikler içeren besiyeriler bir kaynaktan bir başka kaynağa göre çok az farklılık gösterir. Çünkü muhteviyatları özel formülerle belirlenir. Sentetik besiyeriler değişik şekillerde bulunurlar. Örneğin, funguslar için kullanılan minimal besiyeri tuzlar ve suda çözülen amino asitler gibi sadece birkaç esansiyal bileşik içerir. Besiyeri bileşiklerinden tek bir tanesi bile kimyasal olarak tanımlanamıyorsa bu besiyeri bir kopleks ve nonsentetik besiyeridir.

Kompleks ve nonsentetik besiyeri, kimyasal bakımdan en az bir tanımlanamayan madde içeren besiyerilerdir. Bu meddelerin çoğu hayvan, bitki veya maya ekstresi olup, hücre doku veya salgılarının öğütülmesi ile oluşturulur. Kan, serum, et ekstresi (infüzyon) bunlara bazı örneklerdir. Diğer sentetik olmayan katı maddeleri ise, süt, maya ekstresi, soya fasülyesi ekstresi ve pepton'dur. Pepton kısmen sindirilmiş protein olup amino asit bakımından oldukça zengindir. Genellikle karbon ve azot kaynağı olarak kullanılır. Nutrient broht, kan agar ve MacConkey agar fonksiyon ve görünüş olarak farklı olmasına ramen, hepsi de sentetik olmayan besiyerilerdir. Kompleks besin ihtiyaçları olan mikroplar için zengin besin karışımı oluştururlar.

Her Amaca Uygun Besiyeriler

Mikrobiyologlar pek çok amaç için kullanılan çeşitli besiyerilere sahiptir. İlave edilen maddeye bağlı olarak, bir mikrobiyolog besiyeriyi her hangi bir amac için modifiye edebilir.

Genel amaç besiyerleri, mümkün oldukça fazla geniş spektrumda mikroorganizmanın büyüyebileceği şekilde dizayn edilmiştirler. Bu besiyerilere örnek olarak nutrient agar, nutrient broht, brain- heart infüzyon ve tryticase soy agar (TAS)'ı verebiliriz. TAS kısmi parçalanmış süt proteini (kazein), soya fasulyesi ekstresi, NaCl ve agar içerir.

Zenginleştirilmiş besiyeri kan, serum, hemoglobin veya özel büyüme faktörleri (vitamin, amino asid) gibi özel bir türün büyümesini destekleyen maddeleri içeren besiyerilerdir. Büyüme faktörü veya karmaşık besinlere ihtiyaç olan bakteriler kompleks bakteriler olarak isimlendirilirler. Steril koyun, at veya tavşan kanına agar ilave edilerek hazırlanan kan agar besiyeri Fastidious streptococci ve pek çok diğer patojenleri büyütmek için kullanılmaktadır. Patojenik Neisseria( bir türü bel soğukluğuna sebep olur) Thayer-Martin besiyeri veya kan agarın ısıtılması ile hazırlanan çikolata agar üzerinde büyütülür.

Seçici ve Ayırt Edici Besiyeriler

Zekice hazırlanmış bazı önemli besiyerler seçici ve ayırt edici besiyeriler kategorisine girer. Bir basamakta bir cins hatta bir türün ilk identifikasyonuna imkan sağlanır.

Seçici besiyeriler façes, tükürük, deri, su ve toprak gibi farklı pek çok türü içeren örneklerden özel bir tip mikroorganizmanın primer izolasyonunda oldukça önemlidir. İzolasyonu istemeyen organizmayı baskılayarak arzu edilen organizmanın büyümesini teşvik ederek yapar.
Monitol salt agar (MSA) %7.5'lik NaCl içerir. Bu konsantrasyondaki tuz Staphylococcus cinsi hariç çoğu insan patojenlerinin büyümelerini engeller. Staphylococcus bu besiyeriüzerinde iyi bir şekilde büyür, bu yüzden oldukça karışık örnekler içerisinden seçilerek çoğaltılır. Façes bileşiklerinden olan "bile salt"ları pek çok gram olumlu bakterinin büyümesini engellerken gram olumsuz çomak şekilli bakterilerin büyümelerine izin verir. Bağırsak patojenlerinin izolasyonu için kullanılan besiyeriler (MacConkey agar, eozin-metilen blue ( EMB ) seçici madde olarak "bile tuz" içerirler. Metilen mavisi ve kristal violet gibi boyalar aynı zamanda gram-olumlu bakterilerin büyümesini engellerler. Selenit ve brillant yeşil boyası façesten salmonella izolasyonu için, sodyum asid ise su ve besinlerde enterokokküsleri izole etmek için kullanılır.

Farklılaştırıcı besiyeriler, çeşitli mikroorganizmaların büyümelerini sağlarken, bu mikroorganizmaların görünür farklılıklarını ortaya çıkarır. Ayırt etme koloni büyüklüğü ve rengi, besiyeri renginin değişmesinde ve gaz kabarcıkları ve çözeltilerin oluşması şeklinde görülür. Bu değişiklikler besiyerilerinin içeriği maddelerden ve mikroorganizmaların bu maddeler ile olan ilişkilerinden kaynaklanır. Örneğin, bir madde X organizması tarafından kulanılıyor. Y organizması tarafından kullanılmıyor olsun. Böylece X organizması besiyeride gözlenebilir değişiklik oluştururken, Y organizması değişiklik oluşturmaz. En basit ayırt edici besiyeri, özel bir maddenin kullanılması ile iki farklı reaksiyon gösterir. Bazı besiyeriler ise üç veya daha fazla reaksiyon gösterebilir (örneğin TSIA, triple-sugar iron agar).

Boyaların pek çoğu pH indikatörleri olduklarından ve asid ve baz üretimine karşı renk değişiklikleri oluşturduklarından ayırt edici madde olarak kullanılır. Örneğin, MacConkey agar nötral durumlarda sarı, asidik durumlarda ise pembe veya kırmızı renk oluşturan nötral kırmızı boyası ihtiva eder.

Muhtelif Amaçlı Besiyeriler

İndirgeyici besiyeriler, oksijeni absorplayan veya besiyeri oksijeninin peretrasyonunu yavaşlatan bir madde (thioglycollic asit veya sistein) içeren veya oksijen ihtiyacının test edilmesi için kullanılır. Karbonhidrat fermentasyon besiyeri fermentlenebilecek (asitlere dönüşebilecek) şekerler ve bu reaksiyonu gösteren bir pH indikatörü içeren besiyerileridir.

Taşıma besiyerileri, örneklerin klinik analizlerinden önce özellikleri bozulmadan muhafaza edildikleri veya taşındıkları besiyerilerdir. Stuarts ve Amies taşıma besiyerleri tuzlar, tamponlar ve absorbantlar içerir. Bunlar hücrelerin enzimler, pH değişmeleri, toksik materyaller tarafından tahrip olmalarını önler, fakat büyümeyi desteklemez. Test besirerileri antimikrobiyal maddelerin etkilerini test etmek, dezenfektant, antisepsis, kozmetik ve mikroorganizmalardan koruyucu maddelerin etkilerini belirlemek için kullanılan besiyerilerdir. Sayım besiyerileri süt, su, besin, toprak ve diğer örneklerdeki mikroorganizmaların sayısını belirlemek için endüstri veya diğer örneklerdeki mikroorganizmaların sayısını belirlemek için endüstri veya çevra mikroorganizmaları tarafından kullanılan besiyerilerdir.

  Alıntı ile Cevapla

IRCForumlari.NET Reklamlar
radyo44.com.tr
Cevapla

Etiketler
mikrobiyolojide, temel, yöntemler

Seçenekler
Stil

Yetkileriniz
Konu Acma Yetkiniz Yok
Cevap Yazma Yetkiniz Yok
Eklenti Yükleme Yetkiniz Yok
Mesajınızı Değiştirme Yetkiniz Yok

BB code is Açık
Smileler Açık
[IMG] Kodları Açık
HTML-Kodu Kapalı
Trackbacks are Kapalı
Pingbacks are Açık
Refbacks are Açık


Benzer Konular
Konu Konuyu Başlatan Forum Cevaplar Son Mesaj
Mikrobiyolojide Kullanılan Diğer Boyama Yöntemleri Zen Mikrobiyoloji 0 24 Ekim 2012 22:33
Klinik Mikrobiyolojide Önemli Bakteriler Liaaa Mikrobiyoloji 0 13 Mart 2012 00:51
Hızlı Saç Uzatan Yöntemler Ezgi Güzellik, Sağlık ve Bakım Önerileri 0 03 Ağustos 2010 20:41